Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

초록

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 투명체 준비 및 장착

1. 샘플이 투명해지고 충분히 투명해지면 PBS로 실온에서 밤새 세척합니다. 가능한 한 자주 PBS를 새 PBS로 교체하십시오. 이 단계는 이후 단계에서 침전물을 형성할 수 있는 잔류 SDS를 제거하는 데 중요합니다.
2. PBS에서 최종 세척한 후 실온의 탈이온수로 5분 동안 조직을 3회 세척합니다. 이 단계에서 조직이 불투명해지고 확장될 수 있습니다.
3. 굴절률 정합 용액(표 1 참조)에서 조직을 실온에서 최소 4시간 동안 배양합니다. TAG_47 TAG_46 TAG_45그림 1B는 굴절률 정합 용액에서 배양 후 투명화된 조직 조각을 보여줍니다.
4. 굴절률 정합 용액에서 조직을 배양하는 동안 필요한 경우 샘플을 이미지화할 수 있는 적절한 하우징 챔버를 구성합니다.
5. 작은 조직 샘플/조각을 위한 이미징 챔버 구축
   1. 유리 슬라이드를 장착용 베이스로 사용하여 고무 또는 플라스틱 스페이서를 놓고 슈퍼 접착제로 고정합니다. 미리 만들어진 스페이서를 사용할 수 없는 경우 원추형 튜브 단면으로 만든 플라스틱 링을 사용하십시오.
   2. 이 조각들을 구멍 없이 유리 슬라이드에 고정해야 합니다(그림 1C).
   3. 투명화된 조직을 굴절률 정합 용액으로 미리 채워진 장착 챔버에 놓습니다.
   4. 티슈 위에 유리 커버슬립을 놓고 매니큐어로 밀봉하여 티슈를 단단히 장착합니다.
   5. 굴절률과 일치하는 마운팅 용액을 유리 바로 위에 한 방울 떨어뜨려 이 조직을 이미지화합니다.
6. 대형 조직 이미징 챔버
   1. 조직이 두께가 5mm보다 큰 경우(전체 뇌 또는 반구에 적합) 이 챔버를 구성합니다.
   2. 벽이 높은 10cm 유리 접시를 사용하여 중앙에 50mL 원뿔형 튜브를 놓고 원뿔형의 직경이 사용된 대물렌즈의 배럴을 수용할 수 있을 만큼 충분히 큰지 확인합니다.
   3. 물에 아가로스 3%를 만들어 유리 접시와 원뿔형 튜브 사이의 공간에 붓고 1시간 동안 식힙니다(TAG_127 TAG_126 TAG_125그림 1D). 이것은 단단한 아가로스 고리를 형성합니다(그림 1E).
   4. 슈퍼 접착제를 사용하여 조직을 챔버 바닥에 단단히 부착하고 챔버를 굴절률 정합 용액으로 채웁니다. 관심 영역을 손상시키지 않고 접시에서 조직을 재생할 수 있도록 이미지화되지 않을 영역에 조직을 부착하기 위해 접착제를 바르십시오.
      참고: 이 제제는 공기로부터 보존되어 4°C에서 보관되지 않으면 굴절률 매체가 중합을 시작할 수 있으므로 시간에 민감합니다.

2. 투명화된 조직 샘플 이미징

1. {{}}작동 거리가 4mm인 25x/0.95 NA 대물렌즈와 맞물린 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득합니다.
2. 모든 관련 이미징 장비를 켭니다. 샘플을 스테이지에 놓고 굴절률 일치 용액 한 방울을 장착 챔버 상단에 놓습니다.
3. 대물렌즈가 있는 침지 매체에 조심스럽게 접근하고 연속적인 매체 기둥을 형성합니다.
4. epifluorescence를 사용하여 적절한 이미징 필드를 찾습니다.
5. 적절한 설정을 테스트하여 이미지 획득 절차를 시작합니다.
   1. 그림 2A를 가이드로 사용하여 해상도 및 스캔 속도 설정을 설정하는 것으로 시작합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이미징하는 경우 핀홀을 완전히 닫아 가장 작은 광학 단면을 얻을 수 있으므로 최상의 z 해상도를 얻을 수 있습니다.
   2. 높은 신호 대 잡음비로 적절한 이미지를 얻을 때까지 레이저 출력/센서 게인을 점진적으로 높입니다.
   3. 표준 EGFP/tdTomato 2색 이미징을 사용하는 경우 그림 2B를 가이드로 사용하여 집광 설정을 지정합니다.
   4. 관찰된 조직의 시작점과 끝점을 기반으로 z-stack 파라미터를 설정합니다. 그림 2C를 가이드로 사용하여 원하는 z 해상도를 기준으로 단계 크기를 설정합니다.
      참고: 단계 크기가 작을수록 z 해상도가 높아지지만 레이저 체류 시간도 더 길어져 샘플 표백이 발생할 수 있습니다.
   5. 이미지 획득 설정이 만족스러우면 이미지를 획득합니다.
   6. 이미지가 신호 대 잡음비가 높고 구조의 뚜렷한 경계를 보여주는지 확인합니다(그림 2D{{TAG_259 TAG_258 TAG_257 TAG_260}}).

3. 현미경 분석 소프트웨어를 사용한 이미지 처리 및 3D 정량화

참고: 현미경 이미지 분석 소프트웨어 패키지는 3차원 이미지 시각화 및 처리를 위한 강력한 도구입니다. 이러한 프로그램 중 다수는 투명화된 조직 샘플을 이미징하여 생성된 대규모 데이터 세트를 처리하는 데 완벽하게 적합합니다. 다음 단계 및 관련 그림은 Imaris 소프트웨어 워크플로에 해당합니다.

1. 이미지 스택을 열고 선택한 분석 소프트웨어로 가져옵니다.
2. 3차원 공간에서 이미지를 보고 디스플레이 조정기를 사용하여 조회 테이블을 원하는 대로 변경하여 이미지를 더 잘 시각화할 수 있습니다.
   참고: 그림 3A는 CLARITY 조직 투명화와 쌍을 이루는 2-광자 현미경을 통해 접근할 수 있는 극한의 이미징 깊이를 보여줍니다. TAG_313 TAG_312그림 3B{{TAG_315{{TAG_314 TAG_317}}는 {{TAG_에 제시된 z-스택에서 명확하게 보이는 척추 형태뿐만 아니라 뚜렷한 수상돌기 과정을 보여줍니다. 320}}그림 3A.
3. 일관된 배경을 필터링하려면 이미지 처리 버튼을 클릭하고 배경 빼기 필터를 선택합니다.
   참고: 그림 3C는 처리 전에 일관되게 흐릿한 배경 신호가 있는 이미지를 보여줍니다. 그림 3D는 배경 빼기 필터가 적용된 후의 이미지를 보여줍니다.
4. 3D 이미지를 관찰하고 여러 각도와 확대/축소 수준에서 보면서 익숙해집니다.
5. 먼저 필라멘트 추적기 도구를 선택하여 수상돌기 추적을 시작합니다.
6. 를 클릭하여 필라멘트를 수동으로 편집하고 자동 생성을 건너뜁니다.
7. 모드를 자동 경로로 설정하고 자동 중심 및 자동 직경 수정을 확인합니다.
8. Shift + 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 시작점을 설정합니다.
9. 수상돌기의 전체 길이를 따라 뉴런을 추적합니다. 수상돌기의 끝을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 종료 지점을 설정하면 소프트웨어가 시작점과 끝점 사이의 경로를 자동으로 계산할 수 있습니다.
10. 모든 수상돌기에 대해 이 단계를 반복하고 세포 구조를 완전히 추적합니다.
11. 추적된 셀을 시각화하고 정확성을 확인합니다. 필요에 따라 수동으로 조정합니다.
12. 생성 탭을 선택합니다.
13. {{}}{{TAG_447 TAG_449 TAG_448}} 수상돌기 직경 재계산 옵션을 선택합니다.
14. 보다 정확하게 추적된 수상석을 위해 마법사를 따라 완료합니다.
15. 그리기 탭을 선택합니다.
16. 척추 라디오 버튼을 클릭하여 척추 그리기를 시작합니다.
17. 필요에 따라 대략적인 척추 지름을 설정하고 측정 도구를 사용하여 주축 지름을 정확하게 표현합니다.
18. 척추 머리의 중심을 클릭하여 새 척추를 추가합니다.
19. 수상돌기의 모든 가시에 대해 이 작업을 반복합니다.
    참고: 가시를 수동으로 추가할 때 가능한 모든 각도에서 수상돌기를 관찰하는 것이 중요합니다. 위치
20. 새로 추가된 스파인의 정확성을 확인하고 필요에 따라 변경합니다.
21. 생성 탭을 선택합니다.
22. {{}}척추 직경 재계산 옵션을 선택하여 소프트웨어가 적절한 머리와 목 직경을 결정할 수 있도록 합니다. 이는 다운스트림 데이터 분석에 매우 중요합니다.
23. 주축 지름 생성 마법사를 따라 완료합니다.
24. 계산 결과를 관찰하고 필요에 따라 수동으로 조정합니다. TAG_554 TAG_553 TAG_552그림 3E{{}}{{}}{{}}은 척추로 완성된 완전히 추적된 뉴런을 보여줍니다.
25. 분류된 스파인 목록을 만들려면 도구 탭을 선택합니다.
    참고: 이 기능이 작동하려면 MATLAB 확장이 설치되어 있어야 합니다.
    1. MATLAB 확장 프로그램을 설치하려면 기본 설정 창을 엽니다.
    2. 사용자 지정 도구 옵션을 선택합니다.
    3. 적절한 MATLAB 런타임 MCR을 추가합니다.
26. 척추 분류를 클릭합니다.
27. 척추 분류를 위해 원하는 매개변수를 편집합니다.
28. MATLAB 확장에서 Classify Spines를 클릭합니다. TAG_637 TAG_636 TAG_635그림 3F{{TAG_638는 색상으로 구분된 분류 가시로 덮인 수상돌기를 보여줍니다.
29. 통계 탭을 선택합니다.
30. {{}}이 탭의 왼쪽 하단 모서리에 있는 구성 버튼을 클릭하여 데이터를 정량화하도록 원하는 통계를 구성합니다.
31. {{ TAG_670}}통계 표현 방법을 선택했으면 이 창의 오른쪽 하단에 있는 탭으로 통계 내보내기 버튼을 사용하여 데이터를 내보냅니다.
32. 선호하는 그래프 작성 방법을 사용하여 통계량을 그래프로 표시합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
15 mL Conical tube	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Needle	BD	305127
30% 아크릴아미드(No-bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL 원뿔형 튜브	Thermo Scientific
Electrophoretic Tissue Clearing Solution(전기영동 조직 클리어링 솔루션	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
하이드로겔 솔루션 키트	Logos	C1310X
Imaris	옥스포드 악기
파라포름알데히드 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500mL, 6병/케이스	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY 중합 시스템	Logos	C20001
X-CLARITY 조직 세척 시스템 II	Logos	C30001

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