투명화된 마우스 해마 조직에서 성상세포와 흥분성 뉴런의 이광자 현미경 검사

초록

출처: Refaeli, R., et al., Investigation of Spatial Interaction between astrocytes and neurons in cleared brains. J. vis. exp. (2022)

이 비디오는 준비 과정을 보여줍니다. 형광 표지된 성상세포와 흥분성 뉴런 사이의 공간적 상호 작용을 시각화하기 위해 이광자 현미경을 사용하여 제거된 마우스 해마 조직의 챔버 및 신경 이미징.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토 및 승인되었습니다.

1. 챔버 준비

참고: 각 샘플에는 샘플이 배치될 이미징 챔버가 있는 슬라이드가 필요합니다.

1. 슬라이드 중앙에 샘플을 놓습니다.
2. 뜨거운 글루건을 사용하여 슬라이드 가장자리에 거의 티슈만큼 높은 벽을 만듭니다. 모서리 중 하나에 작은 간격(약 5mm)을 남겨 두어야 합니다(그림 1A, B).
3. 샘플에 굴절률 정합 용액 또는 RIMS를 1-2방울 떨어뜨려 상부 표면을 촉촉하게 유지하고 커버슬립과 조직 사이에 기포가 형성되는 것을 방지합니다.
4. RIMS(굴절률 정합 용액) 방울을 도포한 직후, 뜨거운 접착제의 마지막 층을 벽에 추가하고(뇌/슬라이스의 높이에 도달하도록) 즉시 (뜨거운 접착제가 여전히 액체인 동안) 1.5단계로 진행합니다.
5. 커버 슬립으로 상단을 밀봉하고 아직 따뜻한 뜨거운 접착제 층 위에 가능한 한 고르게 놓습니다 (그림 1C).
6. 뜨거운 접착제 벽에 남아있는 틈을 통해 챔버를 RIMS로 채웁니다 ( 그림 1D, E).
7. 뜨거운 접착제로 틈을 메우십시오. 내부에 공기를 남기지 마십시오 (Figure 1F).
8. 뜨거운 접착제 벽이 슬라이드의 경계를 넘어 확장되는 경우 확장 가장자리를 자릅니다(Figure 1G)을 사용합니다.
9. 이미징에 사용되는 대물렌즈가 침수된 경우 침지 용액이 더 오래 지속되도록 커버슬립 위의 벽에 접착제를 2-3mm 더 추가합니다(그림 1H).

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility(EVCF)		성상세포를 감지하는 데 사용되는 바이러스 벡터
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility(EVCF)		바이러스 벡터
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility(EVCF)		바이러스 벡터
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility(EVCF)		바이러스 벡터
Imaris software	Bitplane, UK		이미지의 3D 분석을 허용하는 소프트웨어
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlass software	<	가상 현실을 사용하여 이미지의 3D 분석을 허용하는 소프트웨어
Two Photon Microscope	Neurolabware		Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tube (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365

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