이 비디오는 형광 단백질로 표지된 마우스의 사전 고정된 뇌 조직 절편을 이미징하여 소뇌 과립 뉴런 발달 분석을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 고해상도 Z-stack 이미지를 캡처하고 신경돌기 길이, 수지상 발톱 형성, 표면적 및 부피를 포함한 구조적 매개변수를 측정하여 시냅스 형성을 연구합니다.
방법 논문
다양한 발달 단계에서 소뇌 과립 뉴런의 시냅스 형성 시각화
2025년 5월 29일
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이 논문에서
초록
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프로토콜
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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.
1. 소뇌 과립 뉴런 또는 CGN의 형태학적 분석 - 3차원(3D) 재구성 및 표면적 및 세포 부피
- 이미지 단일 전기 천공 CGN은 2배 줌으로 63x 대물렌즈에서 컨포칼 현미경으로 스택당 0.5μm의 z-stack 이미지를 촬영합니다. 이미지 창당 하나의 셀을 이미지화하여 이미지를 쉽게 분석하고 재구성할 수 있습니다.
- 다음 링크(https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions)를 사용하여 FIJI용 Simple Neurite Tracer 플러그인을 설치하면 3차원(3D) 공간에서 전기천공된 CGN의 구조를 쉽고 효율적으로 추적할 수 있습니다.
참고: 플러그인의 업데이트된 버전이 있습니다(https://imagej.net/SNT).
- Simple Neurite Tracer를 사용하여 눈가림으로 신경돌기 길이와 수지상 발톱 형성을 분석합니다. 전기로 천공된 CGN의 단일 채널 z-stack 이미지를 FIJI에 업로드하고 Plugins | 세분화 | 단순 뉴라이트 추적기(그림 1D).
- 드롭다운 메뉴에 액세스하고 새 3D 뷰어 만들기(그림 1D)를 선택합니다.
- 덴드라이트의 베이스로 스크롤하여 세포 소마에 연결하고 접합부를 클릭하여 경로를 시작합니다. 셀 채우기 신호가 가장 밝은 섹션을 클릭하여 경로를 수동으로 추적하고 [y]를 눌러 추적을 유지합니다. 발톱이 없는 경우 수상돌기의 끝까지 추적하거나 발톱의 바닥까지 추적하고 [f](그림 2D)를 눌러 경로를 확인합니다.
- 다음으로, 구조물의 기저부에서 경로를 시작하고 가장 긴 중성석의 끝까지 추적하여 발톱을 추적합니다. Windows의 경우 [ctrl] 또는 Mac OS의 경우 [alt]를 누른 상태에서 경로를 클릭하여 2차 및 3차 분기를 추적합니다. [f]를 눌러 경로를 확인합니다.
- 트레이스에 대한 측정값이 별도의 창에서 볼 수 있는지 확인합니다. 발톱 가지(1차, 2차, 3차)의 모든 측정값을 더하여 각 발톱의 총 길이를 구합니다.
- 전기천공된 CGN의 표면적과 세포 부피를 분석하려면 Imaris 세포 분석 소프트웨어(https://imaris.oxinst.com/)를 다운로드하십시오.
참고: FIJI는 쉽게 구할 수 있는 무료 플러그인을 사용하여 z-stack 이미지에서 3D로 셀을 재구성하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한 Simple Neurite Tracer에는 볼류메트릭 렌더링 기능이 있지만 아래에 설명된 이유로 Imaris가 사용되었습니다.
- 위치 전기로 천공된 CGN의 z-stack 이미지를 Imaris에 업로드합니다. Surpass를 눌러 3D 재구성 툴킷에 액세스합니다.
- CGN을 재구성하려면 Surfaces를 누르고 이미지 창 내의 셀 전체를 포함하는 관심 영역을 선택합니다. 완료되면 만들기 아래의 오른쪽 하단 모서리에 있는 파란색 앞으로 화살표를 누릅니다.
- 이미지에 서로 다른 신호에 대한 여러 채널이 포함된 경우 전기천공된 CGN이 포함된 채널을 선택하고 파란색 전방 화살표를 누릅니다.
- 사이드바를 사용하여 전기천공된 셀의 신호에 가장 정확하게 맞는 원하는 임계값을 설정합니다. 셀 표면에 더 가깝게 확대하여 임계값을 정확하게 확인합니다. 완료되면 이중 녹색 화살표를 눌러 셀을 재구성하고 메타데이터에서 표면 영역과 볼륨 크기를 가져옵니다.
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결과
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재료
이름 회사 카탈로그 번호 댓글 이마리스 비트플레인 , , , 자이스 780 업라이트 컨포칼 자이스 , 780 ,
재인쇄 및 허가
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