다양한 발달 단계에서 소뇌 과립 뉴런의 시냅스 형성 시각화

초록

출처 : Chan, U., et al., 소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 In vivo Postnatal Electroporation을 활용합니다. J. Vis. 특급. (2021).

이 비디오는 형광 단백질로 표지된 마우스의 사전 고정된 뇌 조직 절편을 이미징하여 소뇌 과립 뉴런 발달 분석을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 고해상도 Z-stack 이미지를 캡처하고 신경돌기 길이, 수지상 발톱 형성, 표면적 및 부피를 포함한 구조적 매개변수를 측정하여 시냅스 형성을 연구합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 소뇌 과립 뉴런 또는 CGN의 형태학적 분석 - 3차원(3D) 재구성 및 표면적 및 세포 부피

1. 이미지 단일 전기 천공 CGN은 2배 줌으로 63x 대물렌즈에서 컨포칼 현미경으로 스택당 0.5μm의 z-stack 이미지를 촬영합니다. 이미지 창당 하나의 셀을 이미지화하여 이미지를 쉽게 분석하고 재구성할 수 있습니다.
2. 다음 링크(https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions)를 사용하여 FIJI용 Simple Neurite Tracer 플러그인을 설치하면 3차원(3D) 공간에서 전기천공된 CGN의 구조를 쉽고 효율적으로 추적할 수 있습니다.

참고: 플러그인의 업데이트된 버전이 있습니다(https://imagej.net/SNT).

3. Simple Neurite Tracer를 사용하여 눈가림으로 신경돌기 길이와 수지상 발톱 형성을 분석합니다. 전기로 천공된 CGN의 단일 채널 z-stack 이미지를 FIJI에 업로드하고 Plugins | 세분화 | 단순 뉴라이트 추적기(그림 1D).
4. 드롭다운 메뉴에 액세스하고 새 3D 뷰어 만들기(그림 1D)를 선택합니다.
5. 덴드라이트의 베이스로 스크롤하여 세포 소마에 연결하고 접합부를 클릭하여 경로를 시작합니다. 셀 채우기 신호가 가장 밝은 섹션을 클릭하여 경로를 수동으로 추적하고 [y]를 눌러 추적을 유지합니다. 발톱이 없는 경우 수상돌기의 끝까지 추적하거나 발톱의 바닥까지 추적하고 [f](그림 2D)를 눌러 경로를 확인합니다.
6. 다음으로, 구조물의 기저부에서 경로를 시작하고 가장 긴 중성석의 끝까지 추적하여 발톱을 추적합니다. Windows의 경우 [ctrl] 또는 Mac OS의 경우 [alt]를 누른 상태에서 경로를 클릭하여 2차 및 3차 분기를 추적합니다. [f]를 눌러 경로를 확인합니다.
7. 트레이스에 대한 측정값이 별도의 창에서 볼 수 있는지 확인합니다. 발톱 가지(1차, 2차, 3차)의 모든 측정값을 더하여 각 발톱의 총 길이를 구합니다.
8. 전기천공된 CGN의 표면적과 세포 부피를 분석하려면 Imaris 세포 분석 소프트웨어(https://imaris.oxinst.com/)를 다운로드하십시오.

참고: FIJI는 쉽게 구할 수 있는 무료 플러그인을 사용하여 z-stack 이미지에서 3D로 셀을 재구성하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한 Simple Neurite Tracer에는 볼류메트릭 렌더링 기능이 있지만 아래에 설명된 이유로 Imaris가 사용되었습니다.

9. 위치 전기로 천공된 CGN의 z-stack 이미지를 Imaris에 업로드합니다. Surpass를 눌러 3D 재구성 툴킷에 액세스합니다.
10. CGN을 재구성하려면 Surfaces를 누르고 이미지 창 내의 셀 전체를 포함하는 관심 영역을 선택합니다. 완료되면 만들기 아래의 오른쪽 하단 모서리에 있는 파란색 앞으로 화살표를 누릅니다.
11. 이미지에 서로 다른 신호에 대한 여러 채널이 포함된 경우 전기천공된 CGN이 포함된 채널을 선택하고 파란색 전방 화살표를 누릅니다.
12. 사이드바를 사용하여 전기천공된 셀의 신호에 가장 정확하게 맞는 원하는 임계값을 설정합니다. 셀 표면에 더 가깝게 확대하여 임계값을 정확하게 확인합니다. 완료되면 이중 녹색 화살표를 눌러 셀을 재구성하고 메타데이터에서 표면 영역과 볼륨 크기를 가져옵니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

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이마리스	비트플레인	,	,
, 자이스 780 업라이트 컨포칼	자이스	, 780	,