깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

초록

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022)

이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

미세아교세포와 뉴런 칼슘 역학의 생체 내 이광자 이미징

1. 쥐를 현미경 장치에 습관화

1. 수술 3주 후 3% 이소플루란으로 마우스에 마취를 유도하고 맞춤형 입체 기구를 사용하여 이광자 현미경의 25x 대물 렌즈 아래에 마우스를 놓습니다(그림 1C). 설정을 위해 마우스는 트레드밀 상단에 설정되고 자유롭게 달릴 수 있습니다.
2. 약 10분 후 현미경에서 마우스를 제거합니다.tage 및 가정용 케이지로 다시 넣습니다. 이광자 이미지를 획득하기 전에 격일로 최소 3회 습관화를 반복합니다.

2. 이광자 이미지 획득

참고: 미세아교세포 활성화가 점차적으로 기저 수준으로 돌아오므로 수술 후 4주 이상 후에 이미지 획득을 수행하는 것이 좋습니다.

1. 3% 이소플루란으로 마우스에 마취를 유도하고 맞춤형 입체 기구를 사용하여 이광자 현미경의 대물 렌즈 아래에 마우스를 놓습니다.
2. 아래 설명된 대로 맞춤형 음영 장치(그림 1A 및 그림 1B)와 시각적 자극을 위한 LCD 모니터(그림 1D)를 설치합니다.
   1. 뇌 표면에 초점을 맞추도록 렌즈를 배치한 다음 이 렌즈 위치를 원래 Z 위치로 설정합니다. x-y 좌표를 일정하게 유지하고 대물 렌즈를 들어 올립니다. 대물 렌즈와 트레드밀에서 마우스와 입체 기기를 제거합니다.
   2. 숯가루와 혼합하여 검게 변한 실리콘을 사용하여 헤드 플레이트 상단에 차양 장치를 부착하고 헤드 플레이트와 차양 장치 사이의 공간이 잘 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
   3. 차광 장치에 증류수를 채운 다음 마우스와 입체 프레임을 대물렌즈 아래와 트레드밀에 다시 고정합니다. 뇌 표면에서 초점면을 조심스럽게 재설정하여 대물렌즈의 깊이를 확인합니다.
      참고: 대물렌즈 손상 위험을 방지하려면 먼저 xyz 좌표를 설정한 다음 대물렌즈의 음영 장치를 적용하십시오. 커버를 먼저 설치한 다음 좌표를 조정하는 것도 합리적이지만 이 옵션에는 신중한 취급이 필요합니다.
   4. 대물 렌즈를 통한 시각 자극에 사용되는 LCD 모니터의 빛 오염을 방지하기 위해 대물 렌즈를 검은색 알루미늄 호일로 덮습니다(그림 1D). 10인치 LCD 모니터를 마우스의 눈 앞 12.5cm에 설정하여 시각적 자극을 제공합니다(그림 1D).
3. 형광 방출 수집 필터는 EGFP 형광(525/50nm 방출 필터) 및 R-CaMP 형광(593/46nm 방출 필터)으로 구성하고 여기 파장은 1,000nm로 구성합니다. 25x 1.1 NA 대물렌즈와 GaAsP PMT를 사용하여 0.25μm/픽셀의 공간 해상도로 이미지를 획득합니다.
4. 레이어 2/3에서 R-CaMP(+) 뉴런과 EGFP(+) 미세아교세포를 동시에 이미지화할 수 있는 이미징 영역을 찾습니다. 이 설정을 위해 그림 2 에서 얻은 데이터는 라이브 이미지 미리보기를 사용하여 파이얼 표면에서 100μm 깊이에 있었습니다. 이미징 영역의 국부 온도 상승으로 인한 광표백 및 손상을 방지하기 위해 여기 레이저의 출력을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
5. 30Hz의 프레임 속도로 이미지를 획득합니다. 이미지 획득과 동시에 100% 대비, 1.5Hz, 0°에서 150°까지 6개 방향에서 12방향으로 30° 단계로 드리프트 격자 시각적 자극을 마우스에 제공합니다.
6. 이미지 획득 후 현미경 스테이지에서 마우스를 제거하고 마우스에서 음영 장치와 입체 기기를 분리한 다음 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10-inch LCD monitor	EIZO	DuraVision FDX1003	격자 시각적 자극을 제시하기 위해
블랙 알루미늄 호일	THORLABS	BKF12
CX3CR1-EGFP mouse	Jackson laboratory	IMSR_JAX: 005582	CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out 마우스 EGFP를 microglia 아래 뇌에서 발현하는 마우스 내인성 Cx3cr1 궤적
DENT SILICONE-V	Shofu Inc	N/A	헤드 플레이트에 음영 device 부착<
Head-plate	Customized	N/A	Material: SUS304, 두께: 0.5mm
Isoflurane	Pfizer	N/A
다광자 여기 현미경	NIKON	N/A	상업 이름은 "A1MP+"
Objective lens	NIKON	N/A	상업적인 이름은 "CFI75 apochromat 25xC W"입니다.
Psychtoolbox		자유 소프트웨어	격자 시각적 자극을 제시하기 위해
음영 장치	Customized	N/A
Stereotaxic instrument	Customized	N/A	이광자 아래에서 마우스를 고정하기 위해 microscope
Treadmill	Customized	N/A

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