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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
미세아교세포와 뉴런 칼슘 역학의 생체 내 이광자 이미징
1. 쥐를 현미경 장치에 습관화
- 수술 3주 후 3% 이소플루란으로 마우스에 마취를 유도하고 맞춤형 입체 기구를 사용하여 이광자 현미경의 25x 대물 렌즈 아래에 마우스를 놓습니다(그림 1C). 설정을 위해 마우스는 트레드밀 상단에 설정되고 자유롭게 달릴 수 있습니다.
- 약 10분 후 현미경에서 마우스를 제거합니다.tage 및 가정용 케이지로 다시 넣습니다. 이광자 이미지를 획득하기 전에 격일로 최소 3회 습관화를 반복합니다.
2. 이광자 이미지 획득
참고: 미세아교세포 활성화가 점차적으로 기저 수준으로 돌아오므로 수술 후 4주 이상 후에 이미지 획득을 수행하는 것이 좋습니다.
- 3% 이소플루란으로 마우스에 마취를 유도하고 맞춤형 입체 기구를 사용하여 이광자 현미경의 대물 렌즈 아래에 마우스를 놓습니다.
- 아래 설명된 대로 맞춤형 음영 장치(그림 1A 및 그림 1B)와 시각적 자극을 위한 LCD 모니터(그림 1D)를 설치합니다.
- 뇌 표면에 초점을 맞추도록 렌즈를 배치한 다음 이 렌즈 위치를 원래 Z 위치로 설정합니다. x-y 좌표를 일정하게 유지하고 대물 렌즈를 들어 올립니다. 대물 렌즈와 트레드밀에서 마우스와 입체 기기를 제거합니다.
- 숯가루와 혼합하여 검게 변한 실리콘을 사용하여 헤드 플레이트 상단에 차양 장치를 부착하고 헤드 플레이트와 차양 장치 사이의 공간이 잘 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
- 차광 장치에 증류수를 채운 다음 마우스와 입체 프레임을 대물렌즈 아래와 트레드밀에 다시 고정합니다. 뇌 표면에서 초점면을 조심스럽게 재설정하여 대물렌즈의 깊이를 확인합니다.
참고: 대물렌즈 손상 위험을 방지하려면 먼저 xyz 좌표를 설정한 다음 대물렌즈의 음영 장치를 적용하십시오. 커버를 먼저 설치한 다음 좌표를 조정하는 것도 합리적이지만 이 옵션에는 신중한 취급이 필요합니다. - 대물 렌즈를 통한 시각 자극에 사용되는 LCD 모니터의 빛 오염을 방지하기 위해 대물 렌즈를 검은색 알루미늄 호일로 덮습니다(그림 1D). 10인치 LCD 모니터를 마우스의 눈 앞 12.5cm에 설정하여 시각적 자극을 제공합니다(그림 1D).
- 형광 방출 수집 필터는 EGFP 형광(525/50nm 방출 필터) 및 R-CaMP 형광(593/46nm 방출 필터)으로 구성하고 여기 파장은 1,000nm로 구성합니다. 25x 1.1 NA 대물렌즈와 GaAsP PMT를 사용하여 0.25μm/픽셀의 공간 해상도로 이미지를 획득합니다.
- 레이어 2/3에서 R-CaMP(+) 뉴런과 EGFP(+) 미세아교세포를 동시에 이미지화할 수 있는 이미징 영역을 찾습니다. 이 설정을 위해 그림 2 에서 얻은 데이터는 라이브 이미지 미리보기를 사용하여 파이얼 표면에서 100μm 깊이에 있었습니다. 이미징 영역의 국부 온도 상승으로 인한 광표백 및 손상을 방지하기 위해 여기 레이저의 출력을 가능한 한 낮게 유지하십시오.
- 30Hz의 프레임 속도로 이미지를 획득합니다. 이미지 획득과 동시에 100% 대비, 1.5Hz, 0°에서 150°까지 6개 방향에서 12방향으로 30° 단계로 드리프트 격자 시각적 자극을 마우스에 제공합니다.
- 이미지 획득 후 현미경 스테이지에서 마우스를 제거하고 마우스에서 음영 장치와 입체 기기를 분리한 다음 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.
