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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토위원회에서 검토 및 승인되었습니다.
1. 조직 처리
NOTE: 4°C에서 하룻밤 동안 0.2M 인산염 완충액에 희석된 4% 파라포름알데히드(PFA)의 심간 관류 및 후고정 후, 뇌는 4°C에서 3일 동안 인산염 완충 식염수(PBS)의 30% 자당으로 전달됩니다. 그 후, 뇌는 분말 드라이 아이스에 얼어 넣고 절편 할 때까지 -80 ° C에서 보관됩니다.
- 메스를 사용하여 뇌의 정중선을 따라 오른쪽과 왼쪽 반구를 분리합니다. 그런 다음 첫 번째 뇌에서 무작위로 하나 또는 다른 반구를 선택합니다. 그런 다음 오른쪽 반구와 왼쪽 반구 사이를 체계적으로 이동합니다(그림 1A). 장착 매체를 사용하여 장축이 디스크에 수직인 상태에서 샘플링된 반구를 표본 디스크에 장착합니다.
- 저온 유지 장치에서 사전 냉각을 위해 번호가 매겨진 여러 접시 용기를 놓습니다.
- 표본 디스크를 저온 유지 장치에 장착하고 해마 전체(Bregma 1.80에서 -7.04)를 관상 평면에서 80μm 두께의 섹션으로 자릅니다(그림 1B).
- 모든 샘플링된 섹션을 냉각된 다중 접시 용기에 연속적으로 배치하여 섹션을 절단 순서로 유지합니다.
- cryoprotectant로 단면도를 완전히 덮고 더 사용할 때까지 용기를 -20 °C로 유지하십시오.
2. 면역 염색
참고: 염색 절차 전반에 걸쳐 개별 단면을 추적하려면 샘플링된 단면을 25웰 염색 그물에 넣습니다. 5번째 절편마다 사용하며, 면역염색 및 후속 세포 계수를 위해 해마당 평균 최종 12(8-16) 절편을 제공합니다.
- 섹션 1과 n 사이에 무작위로 시작하여 n번째 섹션마다 서브샘플링하기 전에 (그림 1C), 컨테이너를 -20°C에서 실온(RT)으로 옮깁니다.
- 예를 들어, 붓을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)로 채워진 페트리 접시에 배치된 25웰 염색 그물로 섹션을 숫자 순서로 옮깁니다.
참고: 이 시점에서, 오비탈 셰이커(섹션 2.3에서 2.9)의 일치하는 유리 접시에 놓인 염색 그물의 섹션을 유지합니다. - 염색망을 일치하는 유리 접시에 옮기고 3% 과산화수소에서 배양하기 전에 실온(RT)에서 PBS에서 10분 동안 섹션을 두 번 세척합니다(H2O2) 증류수(dH2O) 20분 동안.
- 0.1M 사붕산나트륨에서 20분 동안 중화하기 전에 3가지 다른 염산(HCl) 용액(0°C에서 10분 동안 1M, RT에서 2M에서 10분, 37°C에서 2M)으로 섹션을 옮깁니다.
- PBS(세척 완충액)에 희석된 1% Triton X-100에서 3× 10분 배양 후 RT에서 1시간 동안 10% 소 태아 혈청(차단 용액)이 포함된 세척 완충액으로 절편을 옮깁니다.
- 차단 용액에 1:100으로 희석된 마우스-anti-BrdU(5-bromo-2'-deoxyuridine)에서 4°C에서 48시간 동안 섹션을 배양합니다.
- 세척 완충액에서 섹션 3× 10분을 세척하고 세척 완충액에서 1:10으로 희석된 무 과산화효소에서 48시간 동안 배양합니다.
- 5 × 10 분 동안 섹션을 PBS로 전송 한 다음 PBS에서 희석 된 0.01 % 디아미노 벤지딘 (DAB)에서 7 분 동안 0.02 % H2O2 RT에서 10분 동안.
- 일련의 세척(PBS에서 2× 10분, 염화나트륨을 추가하지 않은 인산염 완충액에서 2× 10분)을 완료하고 현미경 슬라이드에 섹션 번호를 순서대로 장착합니다.
- 크레실 바이올렛으로 counterstaining하기 전에 약 30분 동안 섹션을 건조시킵니다.
- 현미경 슬라이드를 슬라이드 랙에 놓습니다.
- dH2O, 그런 다음 슬라이드를 dH2O 15분 동안.
- 섹션을 에탄올에서 세 번 탈수하기 전에 2.12단계를 반복합니다(96% 5분 동안, 99% 2× 2분 동안).
- 크실렌에 섹션을 2× 15분 동안 놓고 장착을 위해 급속 건조 매체를 사용하여 슬라이드를 커버슬립합니다.
- 마지막으로, 현미경 검사에 사용하기 전에 덮개가 미끄러진 슬라이드를 약 24시간 동안 그대로 두십시오.
3. 광학 분획기를 사용한 BrdU 표지 뉴런의 총 수 추정
참고: 분석할 섹션의 수 및 샘플링된 섹션 내의 광학 해부기의 수와 같은 최적의 샘플링 매개변수를 결정하기 위해 몇 가지 동물을 포함하는 파일럿 연구를 수행합니다. 이 파일럿은 또한 예비 CV(표준 편차/평균)와 조사자가 결정한 추정치의 만족스러운 정밀도를 얻기 위해 CE를 조정할 수 있는 가능성을 제공합니다(자세한 내용은 아래 참조). 마찬가지로, z-분포 분석은 조직 수축, 단면 전체의 염색 품질, z축의 세포 분포와 같은 사항을 다룹니다.
- 섹션에 있는 조직의 두께를 확인하여 광학 분획기의 사용에 적합한지 확인하십시오(예: 보호 영역을 포함하여 선택한 해부의 높이에 충분히 두꺼운지). 참고: 조직 두께는 관심 영역 내의 여러 위치에서 측정됩니다.
- 현미경의 전동 스테이지에 슬라이드를 놓고 선호하는 입체 소프트웨어를 켭니다.
- 100X 오일 침지 대물렌즈로 변경하기 전에 저배율 대물렌즈(2X 또는 4X)를 사용하여 관심 영역을 묘사합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'그림 2A).
- 카운팅 프레임의 특정 지점을 사용하여(e., 모서리 또는 모서리에 인접함) 일부 단면 피쳐에 초점이 맞춰질 때까지 초점면을 따라 이동하여 단면의 상단을 찾습니다. 이 z 위치를 0으로 등록합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>그림 2B).
- 카운팅 프레임의 동일한 특정 지점이 초점이 맞춰진 조직의 마지막 z 수준에 있을 때까지 조직을 통해 초점면을 아래로 이동하고 이 위치를 표시합니다. 국소 조직 두께는 0에서 이 끝점까지 정의되며 z축에서 읽을 수 있습니다. 조직 두께를 등록합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>그림 2B).
- 얼룩의 전체 침투와 절편의 전체 두께에서 세포의 분포를 문서화합니다.
참고: BrdU 표지 뉴런의 분포는 필요한 보호 영역을 결정하기 위한 지침으로 사용됩니다. 세포의 균일한 분포가 중요하지만, 단면의 상단과 하단 근처에서 더 적은 수의 세포를 관찰하는 것이 허용되며, 이는 캡 손실의 효과를 나타냅니다.- BrdU 레이블이 지정된 뉴런을 샘플링하고 각 카운팅 프레임의 선택된 모서리에서 측정된 로컬 단면 두께와 함께 z 위치를 등록합니다.
- BrdU 양성 뉴런의 개수를 z 위치의 함수로 플로팅합니다.
- 디렉터 구역과 가드 구역의 높이는 평균 단면 두께와 세포의 분포에 따라 고정되어야 합니다(3.1 및 3.2 참조).
참고: 해부의 높이는 표면에 가까운 인공물을 피하기 위해 단면 두께보다 작아야 합니다. 이 위험은 섹션의 상단과 하단에 보호 구역을 포함하여 우회할 수 있습니다. - 해부기 사이의 단계 길이를 결정합니다.
- 분석할 모든 섹션의 관심 영역을 묘사하고 영역을 등록합니다.
- 이 영역을 합산하고 이 영역 내에 배치된 해부기의 수로 나눕니다.
참고: 이전 경험에 비추어 볼 때, 좋은 시작점은 75개의 프로브를 수반합니다. 이렇게 하면 영역과 해당 샘플링 위치가 근사화됩니다(Astep). - Astep, x-y-step 크기를 제공합니다.
- 계수 프레임의 크기를 결정합니다.
- 카운팅 프레임의 크기를 임의의 단위로 설정하고 섹션 3.3 및 3.4에서 얻은 매개변수를 사용하여 BrdU 양성 뉴런의 파일럿 샘플링을 수행합니다.
참고: 크기는 시행착오를 통해 경험적으로 결정되어야 하지만, 해부기당 2-3개의 세포를 샘플링할 수 있도록 조정하는 것이 좋습니다.
- 파일럿 연구의 마지막 단계에 따라 세포 샘플링을 시작합니다.
참고: 얻어진 샘플링 매개변수는 각 동물에서 약 150-200개의 세포를 수화해야 하며, 이는 효율적인 입체 설계를 얻기에 충분해야 합니다. - 100× 오일 이멀젼 대물렌즈와 최종 배율 2000-3000×를 사용하여 BrdU 양성 뉴런을 계산합니다. 각 광학 해부기에서 관심 특징으로 인식되거나(본 연구에서 기준은 BrdU 레이블 뉴런의 선행 가장자리가 처음으로 초점이 맞춰질 때), 카운팅 프레임 내부에 있거나 포함 선(그림 2B). 해부기 높이 내부의 관심 특징으로 명확하게 인식될 때 제외선에 닿는 BrdU 양성 뉴런을 세지 마십시오. 전체 입체 정량화에 걸쳐 이러한 계수 규칙을 주의 깊게 따르는 것이 매우 중요합니다.
참고: BrdU가 모든 분열 세포에 통합됨에 따라 형태학은 뉴런과 다른 유형의 세포를 구별합니다. 뉴런 특성은 중성 세포질(neutral cytoplasm)과 어두운 핵소체(dark nucleolus)를 가진 명확하게 정의된 핵입니다. BrdU 양성 세포는 신경교세포(glial cell)보다 크기가 크기 때문에 새로 형성된 뉴런으로 인식됩니다. 단기 증식(예: < 2,4시간)에 대한 연구에서는 미성숙 신경 세포 마커를 사용한 이중 염색이 전제 조건이 될 수 있습니다.
