형광 현미경을 사용한 Drosophila Pupal Eye의 라이브 이미징

초록

출처: Hellerman, M. B., et al. Pupal Eye의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015)

{{TAG_ 28}}이 비디오는 Drosophila melanogaster 번데기의 눈 패턴을 연구하기 위한 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 녹색 형광 단백질(GFP) 태그 마커를 사용하면 발달 중인 눈 구조가 형성되는 동안 세포 조직 및 분화를 시각화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 형광 이미징

1. 형광 현미경을 사용하여 번데기 제제 를 이미지화합니다. 매 7분마다 adherens junctions 영역에서 눈 신경 상피의 정점 도메인을 통해 연속적인 절편을 캡처합니다.
   참고: a) 적절한 직렬 섹션은 일반적으로 0.2μm z-단계로 구성된 z-스택당 4-5개입니다. b) 가벼운 융기 및 주름을 포함한 상피 토폴로지의 불규칙성은 조직의 큰 영역에 대한 초점이 맞는 이미지를 획득하는 것을 어렵게 만들 수 있습니다. 이미징하는 동안 관심 영역의 일부에 초점이 맞춰지고 인접 영역에 초점이 맞지 않는 것을 발견할 수 있습니다. 번데기 눈과 커버슬립 사이에 작은 증류수 방울을 포함하면 일부 급성 조직 주름을 제거할 수 있지만 번데기 눈 형태 형성의 초기 단계에서 특징적인 약간 고르지 않은 토폴로지 특성은 제거할 수 없습니다. 이러한 경우, 전체 필드에 대해 초점이 맞춰진 슬라이스가 획득될 때까지 z-스택을 확장하여 조직을 오버샘플링합니다. c) 7분마다 연속 절편을 캡처하면 이미지 품질을 손상시킬 수 있는 녹색 형광 단백질(GFP) 형광의 강도를 크게 감소시키지 않고 3-4시간 동안 라이브 이미징이 가능합니다. 시간 간격이 짧을수록 총 이미징 시간이 단축될 수 있습니다.
2. 3-4시간 동안 이미징을 계속합니다. 번데기 성장과 혈림프의 펌핑으로 인해 망막의 위치가 이동하고 14-21분마다 주의 깊게 다시 초점을 맞춰야 하므로 많은 형광 현미경에서 사용할 수 있는 자동 초점 및 시간 기능을 사용하지 마십시오.

참고: 4시간 이상의 이미징은 눈의 형태 형성을 늦추거나 지연시킬 수 있습니다.

3. 적절한 디콘볼루션 소프트웨어를 사용하여 배경을 줄이고 연속 섹션 이미지의 대비를 향상시키십시오. 각 z-stack 파일에 대해 Leica 애플리케이션 제품군 고급 형광(LAS AF) 소프트웨어에서 다음을 수행합니다. 도구 패널로 이동하여 3D 디콘볼루션을 선택하고 적용을 클릭합니다.
4. 디콘볼루션된 각 스택 파일에 대한 MP(최대 투영) 이미지 생성: 도구 패널로 이동하여 3D 투영을 선택하고 적용을 클릭합니다.
   참고: MP 알고리즘은 과다 샘플링된 조직에 대해 균일하게 초점이 맞는 이미지를 생성하지 못할 수 있습니다.

2. 이미지 처리

1. 자동 이미지 정렬:

참고: 살아있는 초파리 조직은 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 이동하고 성장합니다. 결과적으로, 연속적인 시점에서 수집된 이미지의 중심은 초파리 조직의 동일한 지점과 일치하지 않을 수 있습니다. 또한, 전체 망막 디스크는 번데기 형성(APF) 후 ~21시간에서 23시간 사이에 약 30° 회전합니다. 개별 세포 행동을 강조하고 유기체 성장으로 인한 산만함을 줄이려면 각 MP 이미지를 정렬합니다. 이 작업은 수동으로 수행할 수 있지만 여기에 사용된 이미지 편집 소프트웨어에는 프로세스를 신속하게 처리할 수 있는 알고리즘이 내장되어 있습니다.

2. 메인 메뉴의 File(파일) 탭에서 Scripts(스크립트)를 열고 Load Files into Stack(스택에 파일 로드)을 선택합니다.
3. MP 이미지 파일을 [레이어 로드] 패널로 가져오고 [확인]을 선택합니다. [소스 이미지 정렬 시도] 옵션이 자동으로 선택되지 않았는지 확인합니다.
4. 참고: 이 옵션을 선택하면 소프트웨어가 이미지 데이터를 왜곡하는 정렬 알고리즘을 사용할 수 있습니다.
5. 모든 MP 파일이 레이어 창에 로드되면 가장 빠른 시점이 레이어 스택의 맨 위에 오도록 모든 이미지가 시간순으로 되어 있는지 확인합니다. 레이어의 순서가 올바르지 않으면 올바르게 정렬될 때까지 레이어를 끌어다 놓습니다.
6. 메인 메뉴의 Edit 탭에서 Auto-Align Layers를 선택합니다. 위치 변경을 선택하고 확인을 클릭합니다.
7. 자동 정렬 알고리즘이 프레임을 관련 초점으로 배치하지 못하면 이동 도구를 사용하여 약간 조정하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
GMR-GAL4; UAS-a-고양이 : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b
UAS-DCR-2; UAS-a-cat : GFP, 유비 - 드 - Cadherin : GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1mm 유리 현미경 슬라이드	Fisher Scientific	12-550-413
22 x 40mm 유리 커버 슬립	VWR	48393-172
집게	파인 사이언스 도구	91150-20
Whatman 3mm 크로마토 그래피 종이	Fisher Scientific	05-713-336
바셀린	Fisher Scientific	19-086-291
30ml 주사기	Fisher Scientific	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM 현미경	Leica Microsystems
LAS AF 버전 2.6.0.7266 현미경 소프트웨어	Leica Microsystems