살아있는 쥐 해마에서 형광 표지된 뉴런의 종방향 이광자 이미징

초록

출처: Ulivi, A. F., et. al. 살아있는 마우스에서 등쪽 해마 CA1의 종방향 이광자 이미징. J. Vis. 특급. (2019)

이 비디오는 살아있는 쥐에서 형광 표지된 피라미드 뉴런의 종방향 이광자 이미징을 보여주며, 해마 CA1 영역의 뉴런 구조를 연구하기 위한 수상돌기 및 수지상 가시의 준비, 캐뉼라 정렬 및 이미징을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 이미징 세션 준비
2. 미리 이미징 설정을 켜고 필요한 경우 레이저가 예열되고 안정화되도록 합니다.
3. 마우스를 마취합니다. 1 L / min O₂고 의식을 잃을 때까지 기다립니다. 발가락 핀치 반사 테스트를 사용하여 마취를 평가합니다.
4. 집게를 사용하여 헤드 홀더 플레이트에서 접착 필름을 조심스럽게 제거합니다. 마우스를 손에 들고 손가락으로 헤드 홀더 플레이트를 잡습니다. 준비물이 손상되지 않도록 필름을 부드럽게 제거하십시오.
5. 현미경 아래의 가열 카펫 위에 마우스를 놓고 헤드 플레이트를 홀더에 고정합니다(그림 1D).
6. 콧방울을 주둥이를 덮도록 배치하고 이소플루란을 1.5-2%로 줄입니다.
7. 쥐의 눈에 안과 연고를 바릅니다.
8. 이미징 캐뉼러를 탈이온수로 헹궈 청소합니다. 주사기와 얇은 바늘을 사용하여 캐뉼라에 물을 떨어뜨리고 진공 펌프를 사용하여 제거합니다.

2. 이미징 session

1. 저배율 및 긴 작동 거리 대물렌즈를 사용하여 캐뉼라에 잔류 물, 먼지, 무결성 및 형광 존재 여부가 있는지 육안으로 확인합니다.
2. 헤드 홀더 암의 각도를 조정하여 캐뉼라를 광축에 맞춥니다.
3. 25X 1.0 NA(개구수), 4 mm WD(작동 거리) 또는 40X 0.8 NA, 3 mm WD 침수 대물렌즈로 전환합니다. 캐뉼러를 채울 수 있도록 충분한 탈이온수를 추가하고 캐뉼라 위에 여분의 물을 유지하십시오. 기포의 형성을 피하십시오.
4. 이광자(2P) 여기 및 이미지 형광 신호를 사용합니다.
   참고: 이미징 프로토콜은 이미징할 시간과 공간 규모에 크게 의존합니다. 이 문서에 표시된 이미지를 생성하는 데 사용한 이미징 설정에 대한 자세한 내용은 섹션의 대표적인 결과 및 토론을 참조하십시오.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스테인레스 스틸 튜브 Ø 3,0 x 0,25 mm (내부 Ø 2,5 mm) L = 500 mm	Sawade	R00303	캐뉼라 메탈 링용 스테인리스 스틸 튜브
현미경 커버 유리(4mm 라운드)	엥겔브레히트 메디진과 Labortechnik		캐뉼라 유리용 유리 커버슬립
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	Liquid 마취용 isoflurane
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Isoflurane 기화기
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurane scavenger system
CMA 450 온도 컨트롤러	Hugo Sachs Elektronik - Harvard Apparatus GmbH	8003770	난방 담요
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	<
Head plates	사용자 정의 made		30 mm x 10 mm 크기; 직경 8 mm 구멍, titanium
Head plate clamp	맞춤 제작	Head plate holder
받침대 포스트 홀더	Thorlabs	PH20E/M	헤드 플레이트 홀더
스테인레스 스틸 포스트	Thorlabs	TR30/M	헤드 플레이트 홀더
스테인레스 스틸 포스트	Thorlabs	TR75/M	헤드 플레이트 홀더
스테인레스 스틸 포스트	Thorlabs	TR150/M	헤드 플레이트 홀더
Post 커넥터 클램프	Custom made		헤드 플레이트 홀더
알루미늄 브레드보드, 300 mm x 450 mm x 12.7 mm, M6 Taps	Thorlabs	MB3045/M	현미경 스테이지
7" x 4" 랩 잭	Thorlabs	L490/M	현미경 스테이지
로우 프로파일 페이스 마스크 작은 마우스	Emka Technologies	VetFlo-0801	마취 안면 마스크 홀더
파워 미터 모델 1918-R	newport		파워 미터
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies	<
이광자 현미경	Bruker	울티마 IV	2광자 현미경
이광자 현미경	Thorlabs	베르가모	2광자 현미경
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Cosmos		Objectives
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Objectives
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Cosmos		Objectives
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Objectives
2P 여기를 위한 Ultafast 조정 가능한 레이저	Spectraphysics	mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
2P 여기를위한 Ultafast 조정 가능한 레이저	InSight DS+ 듀얼 빔	Excitaiton lasers
3P 여기를위한 Ultafast 조정 가능한 레이저	Monaco	Excitaiton 레이저

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