동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리위원회와 JoVE 수의사에 의해 검토되었습니다. 검토 위원회.
1. 플루오로골드(FG)를 사용한 역행 추적 연구
- 외과적 절차
- 쥐 두개골 경막에서 관심 좌표 영역을 결정합니다.
- 10μL 마이크로 시린지를 준비하고 액상 파라핀으로 테스트합니다.
- 복강내 주사를 통해 트리브로모에탄올 용액(150mg/kg)으로 쥐를 마취합니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 전기 면도기로 쥐의 머리를 면도하십시오.
- 쥐에게 뭉툭한 이어바를 끼우고 입체 장치에 올려 놓습니다. 그런 다음 입 홀더를 놓고 눈에 안과 연고를 바릅니다.
- 10% 포비돈 요오드와 75% 에탄올을 사용하여 머리 피부의 수술 부위를 청소합니다.
- 두피의 정중선을 따라 절개합니다.
- 멸균 목화 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골에서 골막과 근육 조직을 무뚝뚝하게 제거합니다(그림 1A).
- 중간 수막 동맥(MMA) 위의 왼쪽 두정골 및 측두골에 둥근 팁 비트(#106)가 있는 버 드릴을 사용하여 작은 구멍(~5-7mm)을 뚫고 두개골 경막이 손상되지 않았는지 확인합니다(그림 1B).
- 트레이서의 확산을 제한하기 위해 치과용 규산염 시멘트로 구멍 주위에 은행을 구축합니다(그림 1C).
- 10 μL 마이크로 주사기를 사용하여 MMA 주위의 구멍에 2 μL의 2% FG를 추가합니다(Figure 1D).
- 작은 지혈 스폰지 조각으로 구멍을 덮습니다.
- 구멍에 파라핀 필름 조각을 놓고 뼈 왁스로 가장자리를 밀봉하여 추적자의 누출을 방지하고 주변 조직을 오염시키지 않습니다.
- 멸균실로 상처를 봉합합니다.
- 쥐가 완전히 회복될 때까지 따뜻한 곳에 보관하십시오.
- 쥐를 우리로 다시 돌려보내고 식수에 항생제와 진통제를 넣으십시오.
- 관류 및 섹션
- 7일 생존 후, 이 쥐들을 관류시켜라.
- 삼차신경절(trigeminal ganglion, TG)과 C1-4 등뿌리신경절(dorsal root ganglia, DRG)을 해부한 후, 사후 수정(post-fix)하고 동결 보호한다(그림 1F).
- TG 및 DRG를 저온 유지 장치 마이크로톰 시스템에서 시상 방향으로 30μm 두께로 절단하고 실란으로 코팅된 유리 슬라이드에 장착합니다.
- TG 및 DRGs의 FG- 및 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드(CGRP) 라벨링에 대한 이중 면역 형광<br />참고: FG-라벨링은 추가 염색 없이 수은 램프 아래에서 자외선(UV) 조명으로 직접 관찰할 수 있지만, FG가 있는 라벨링된 뉴런은 경막 CGRP-면역반응성의 기원을 밝히기 위해 FG 및 CGRP와 함께 이중 면역형광을 사용하여 TG 및 자궁경부 DRG에서 추가로 검사되었습니다 TG 및 DRG의 신경 섬유.
- 조직화학 펜으로 섹션을 동그라미로 그립니다.
- 0.1M 인산염 완충액(PB)에 3% 노멀 당나귀 혈청과 0.5% 트리톤 X-100을 함유한 차단 용액에서 절편을 30분 동안 배양합니다.
- 4°C에서 하룻밤 동안 1%의 일반 당나귀 혈청과 0.5% Triton X-100을 함유한 0.1M PB의 토끼 항 플루오로골드(1:1000) 및 마우스 항 CGRP 항체(1:1000) 용액으로 샘플을 옮깁니다.
- 다음 날 0.1M PB에서 섹션을 세 번 세척합니다.
- 당나귀 항토끼 Alexa Fluor 594 (1:500) 및 당나귀 항 마우스 Alexa Fluor 488 (1:500) 2 차 항체의 혼합 용액에서 1 % 일반 당나귀 혈청과 0.5 % Triton X-100을 함유 한 0.1M PB의 혼합 용액에서 실온에서 1.5 시간 동안 배양합니다.
- 섹션에 커버 슬립을 씻고 적용하십시오.
- 관찰 및 기록
- 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 UV 조명 아래에서 TG 및 DRG의 FG 표지 뉴런 이미지를 촬영합니다.
- 디지털 카메라가 장착된 형광 현미경으로 TG 및 DRG에서 FG 및 CGRP 표지 뉴런의 이미지를 캡처합니다.
- 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지의 밝기와 대비를 조정하고 사진에 레이블을 추가합니다.
