컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시의 레이저 절제 신경마스트 세포의 회복 모니터링

초록

출처: Volpe, B. A., et al. 제브라피시 신경마스트 세포에서 컨포칼 현미경 기반 레이저 절제 및 재생 분석. J. Vis. 특급{{TAG_ 31}} (2020)

이 비디오는 컨포칼 현미경을 사용하여 제브라피쉬의 신경마스트 간 세포 회수를 모니터링하고 타임 랩스 형광 이미징을 통해 세포 사멸 및 복구를 추적하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. 재생 연구를위한 절제 후 이미징 및 타임 랩스 현미경

1. 드롭다운 메뉴를 클릭하십시오. "Channels". 채널에서 "DAPI"(4',6-디아미디노-2-페닐린돌) 추적을 통해 절제 레이저를 비활성화합니다. "Acquisition mode".
2. 획득 모드에서 "Zoom"를 클릭합니다.
3. 슬라이더를 사용하거나 "0.7."
   1. 성공적인 세포 절제를 보장하려면 게인을 900으로 늘리고 시야를 빠르게 스캔하십시오.
      참고: 표적 세포 내에서 GFP(녹색 형광 단백질)가 보이지 않아야 합니다. 사전 절제 이미징에 대해 설명된 것과 동일하거나 유사한 설정을 사용하여 절제 후 이미지를 캡처하고 저장합니다(그림 1C). 이미지에서 형광 세포의 잔해 또는 제거해야 하는 추가 세포체가 드러나는 경우 레이저 절제 단계를 반복하여 신경마스트 세포 스트링에 눈에 띄는 간격을 만듭니다.
   2. T-PMT(Transmission Photomultiplier Tube) 채널 이미지를 검사하여 세포 손상을 추가로 확인합니다. 손상된 세포는 과립 모양을 가지며 핵은 자주 부풀어 오르거나 모양이 불규칙해집니다(그림 2).
4. 사전 절제 이미지를 캡처하고, 필요에 따라 세포를 절제하고, 각 개별 스테이지 위치에 대한 절제 후 이미지를 캡처한 후, 이미지 캡처를 위한 스테이지 위치와 시간 옵션을 모두 활성화하여 타임 랩스 현미경을 설정합니다. 시간 매개변수를 24시간 또는 원하는 다른 끝점 및 15분 간격으로 설정합니다. 이미지를 획득하기 위한 실험을 시작하고 완료되면 결과 파일을 저장합니다(다음 날).
5. 유충을 더 연구하거나 키워야 하는 경우, 미세한 집게를 사용하여 아가로스에서 조심스럽게 제거한 다음 회복을 위해 트리카인이 없는 E3 배지로 옮깁니다. 더 이상 사용하지 않을 경우, 승인된 동물 프로토콜에 따라 안락사시키고(얼음 욕조에 빠르고 지속적으로 담그는 것이 일반적인 방법임) 기관에서 요구하는 대로 폐기합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
12-well PTFE Printed Slides	전자 현미경 과학	63425-05<
15 mM Tricaine stock solution	Sigma	E10521	15mM Tricaine
1X E3 + 600 μM Tricaine			1X E3 미디어에서 15mM Tricaine 스톡 25X 희석
1X E3 media			역삼투압수(16.7ml/L)에서 60X E3 미디어를 1X로 희석합니다.
60 X E3 media	Sigma-Aldrich에서 구매한 모든 구성 요소		34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water
Bx60 Compound Optics with mercury arc lamp fluorescence<
LSM 700 컨포칼 현미경	Carl Zeiss Microscopy, LLC		절제에는 5mW 405nm 레이저가 사용되었습니다. 절제 및 이미징은 NA가 1.40
FIJI/ImageJ 이미지 처리 소프트웨어	여러 기여자	https://fiji.sc/ 에서 다운로드 가능
해부 바늘을 헤어 나이프로 수정	Fisher Scientific	19010	속눈썹은 나무 손잡이 해부 바늘 끝에 붙여졌습니다.
Microsoft Excel software	Microsoft Corp.		Google 스프레드시트는 Microsoft Excel의 무료 대안입니다
1.5 커버 슬립이 있는 유리 바닥 35mm 접시, 20mm 창	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	35mm 페트리 접시, 20mm 유리창
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
Low Gelling Agarose	시그마 생명 과학	A9414-256<
74 um 폴리 에스테르 메쉬, 24mm 삽입	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		https://rstudio.com/ 에서 다운로드 가능
SMX-168-BL 스테레오 현미경	Motic
Transfer Pipette	Fisher Scientific	13-711-7M
ZEN 소프트웨어	Carl Zeiss Microscopy, LLC

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