Calcium Imaging of enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus(마우스 결장 근육총에서 장 뉴런 및 신경교 활동의 칼슘 이미징)

초록

출처: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca²⁺ 장 신경계의 영상. J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 칼슘을 보여줍니다. 마우스 Colonic Myenteric plexus 제제에서 장 뉴런 및 신경교세포의 활동을 시각화하고 분석하기 위한 이미징.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다. 위원회.

1.Prepare Krebs 버퍼를 수정했습니다.

구성 요소의 최종 농도(mM)가 다음과 같도록 수정된 Krebs 버퍼를 만듭니다: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 피루브산 1개 및 포도당 8개(NaOH로 pH 7.4로 조정). Ca²⁺ 이미징 및 전체 마운트 해부.

2. 이미징 및 분석

참고: 형광등, 현미경, 고품질 CCD 카메라 및 적절한 획득 소프트웨어가 있는 기본 이미징 장비를 사용하십시오. 광원과 특정 응용 프로그램에 따라 다른 구성 요소의 추가를 변경합니다. 필터 휠과 셔터는 기존의 제논 아크 광원과 함께 사용해야 합니다. 그러나 LED 광원 및 조명 시스템에는 이러한 구성 요소가 필요하지 않습니다.

1. 현미경 아래에 기록 챔버를 배치하고 여러 개의 가열된 주사기 저장소가 있는 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 37°C Krebs 버퍼의 2-3ml/min의 연속 관류 속도를 설정합니다. 진공 트랩에 연결된 입력 라인과 흡입 라인 모두에서 기포가 형성되지 않도록 하십시오.
2. 명시야 조명 아래에서 원하는 신경총에 초점을 맞춥니다. 광표백을 유발할 수 있는 조직을 과도하게 노출하지 마십시오.
3. 신경절 내 Fluo-4 부하를 검사하고 이미징을 위해 건강한 신경절을 선택합니다. 건강하지 않은/손상된 신경절은 자가형광 또는 반점 형태를 나타내므로 이미징에 사용해서는 안 됩니다.
4. 신경절이 선택되면, 빛의 경로를 카메라로 전환하고 이미지 획득 소프트웨어로 실시간 이미지를 획득합니다. 신경절에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 이미지 획득 속도와 노출 시간을 설정합니다.
   참고: 이미지 획득 속도와 시간은 조사관이 기록하고자 하는 이벤트에 따라 달라집니다. 대부분의 실험에서 이미지는 전통적으로 신경교세포의 경우 0.5-1Hz, 뉴런의 경우 최대 2-10Hz로 획득됩니다. glial Ca²⁺ 응답은 Ca²⁺ 뉴런의 트랜지언트.
5. 실험을 시작하고 30초 동안 기준선 활동을 설정합니다.
6. 중력 흐름 관류 시스템을 사용하여 수용체 작용제 및 길항제와 같은 사전 예열 된 관심 약물을 2-3 ml / min의 속도로 도포합니다. 작용제/길항제의 적용을 따라 정상 완충액의 관류로 돌아가 최소 10분의 세척/회복 기간을 허용합니다.
   참고: 약물 적용 시간은 개별 화합물 및 실험 설계에 따라 다릅니다. 일반적으로 작용제를 20-30초 동안 적용하면 뉴런과 신경교세포에서 G-단백질 결합 수용체를 활성화하기에 충분합니다. 그러나 리간드 개폐 이온 채널(예: 니코틴성 아세틸콜린 수용체)은 5-10초 이하의 적용 시간이 필요합니다. 더 많은 기간 동안 노출되면 리간드 게이트 이온 채널이 빠르게 둔감해질 수 있습니다. 수용체 경로의 완전한 차단을 보장하기 위해 길항제를 약 3-15분 동안 적용해야 합니다. 그러나 이것은 총체적인 일반화이며 연구자는 항상 특정 패러다임에서 모든 실험 약물을 최적화해야 합니다.
7. 녹화를 중지하고 실험의 타임랩스 동영상을 봅니다. 적절한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 영역(ROI)을 신중하게 선택합니다.
8. 소프트웨어를 사용하여 ROI 형광 강도를 초기 기준선 형광 값과 정규화하고 비교합니다. 정규화된 형광의 변화는 [Ca²⁺의 변화에 정비례합니다.].
   1. ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background를 사용하여 앞에서 설명한 방법을 수정하여 평가 정확도를 향상시킵니다. 이러한 변형은 myenteric plexus의 기저에 있는 근육층의 움직임을 나타내는 조직 제제의 형광 변화로 인한 소음을 줄이는 데 도움이 됩니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine 과학 도구	Minutien Pins
iQ Live Cell Imaging Software	andor	Andor iQ3
Potassium chloride	Sigma	P3911
염화마그네슘	시그마
Sodium chloride	Sigma	S9888
Sigma	S8282
Sodium bicarbonate	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	andor	Neo 5.5 sCMOS
N7510
Peristaltic pump	하버드 장치	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
Temperature Controller	워너 인스트루먼트	TC-344C

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