Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

초록

출처: Moye, S. L., et.al. Lucifer Yellow Iontophoresis를 사용한 성상세포 형태 시각화. J. Vis. Exp. (2019).

이 비디오는 고정된 뇌 절편에서 성상세포 형태를 연구하기 위해 형광 염료 이온 영동을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저전압 전류 하에서 음이온성, 친수성 염료를 세포질로 전달하기 위해 전극으로 성상세포체(astrocyte soma)를 뚫는 방법을 자세히 설명하여 염료가 체세포(soma)와 가지를 확산시키고 표지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 표지된 성상세포를 시각화하여 형태학적 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. Filling Astrocytes with Iontophoresis

1. 전극을 테스트합니다.
   1. 실온에서 0.1M PBS로 채워진 유리 바닥 접시에 뇌 조각을 부드럽게 놓습니다. 나일론 현이 있는 플래티넘 하프로 슬라이스를 제자리에 고정합니다.
   2. 전극이 전압 소스에 연결되어 있는지 확인하고 접지 전극을 뇌 절편이 들어 있는 욕조에 넣습니다.
   3. 대물렌즈를 관심 있는 뇌 영역으로 이동합니다.
   4. 전극을 용액으로 내립니다. 밝은 필드 아래에서 시야의 중앙으로 이동 view 40x 침수 렌즈로 주의 깊게 검사하여 파편이나 기포가 없고 투명하게 보이는지 확인합니다. 전극 팁을 막고 있는 것이 있으면 새 것으로 교체하십시오.
      참고: 막힘은 200MΩ 전극의 문제입니다. 모든 실험 전에 염료 용액을 원심분리하고 여과하면 이것이 빈번한 문제가 되지 않습니다. 그러나 전극의 끝이 작기 때문에 조직이 개구부에 끼일 수 있습니다. 저자는 이를 방지할 방법을 찾지 못했지만 새 전극을 사용하기만 하면 쉽게 처리할 수 있습니다.
   5. 명시장 아래에서 표면 바로 위에서 멈추는 슬라이스 쪽으로 전극을 천천히 내립니다. 위치
2. 성상세포를 이온토포동으로 채웁니다.
   1. 절편 표면 아래 40−50 μm에서 적외선-적색 미분 간섭 대비(IR-DIC)를 사용하여 성상세포를 식별합니다. 직경이 약 10μm인 길쭉한 타원형 모양의 소마타를 가진 세포를 찾습니다. 성상세포가 선택되면 시야의 중앙으로 이동합니다.
      참고: 이온영동에 좋은 세포는 주변에 명확하고 정의된 경계가 있습니다. 슬라이스 표면에 너무 가까운 셀은 완전히 채울 수 없으므로 선택하지 마십시오. 염료 충전을 위한 성상세포를 일상적으로 식별할 수 있으려면 며칠에 걸쳐 약간의 연습이 필요합니다. 실험에 사용된 뇌 영역에 따라 성상세포의 수가 달라질 수 있습니다. 이는 주입 전에 성상세포를 식별하는 데 필요한 시간에 영향을 미칠 수 있습니다.
   2. 전극 팁을 슬라이스 안으로 천천히 내리고 세포체와 같은 평면에 있을 때까지 조직을 탐색합니다.
      참고: 조직이 손상되지 않도록 전극을 천천히 움직입니다.
   3. 성상세포의 세포체가 명확하게 보이고 윤곽이 그려지면 전극을 천천히 부드럽게 앞으로 전진시킵니다. 팁이 세포의 소마를 관통할 때까지 전극을 움직입니다. 대물렌즈의 초점을 천천히 위아래로 움직여 전극이 소마 내부에 있는지 확인합니다.
      참고: 전극 팁은 세포체 내부에 있어야 하며 솜씨에 작은 움푹 들어간 곳이 관찰되어야 합니다. 팁이 셀을 통과하지 않도록 전극을 더 이상 움직이지 마십시오.
   4. 전극 팁이 셀 내부에 있으면 ~0.5-1V에서 자극기를 켜고 셀로 전류를 지속적으로 방출합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 세포가 채워지는 것을 관찰합니다. 디지털 줌을 높여 셀의 세부 사항을 확인하고 전극 끝이 셀 내부에서 보이는지 확인합니다.
      참고: 염료가 셀 밖으로 누출되거나 근처의 다른 셀을 채우는 것으로 보이면 전압을 낮추십시오. 염료가 여전히 세포 밖으로 누출되는 것 같으면 전극을 천천히 당겨 다른 세포를 찾으십시오. 염료가 누출되지 않는 것이 최종 이미지에서 높은 신호/배경 비율을 갖는 것이 중요합니다.
   5. 더 미세한 가지와 과정이 정의될 때까지 약 15분 동안 기다렸다가 전압을 끄고 셀에서 전극 끝을 부드럽게 빼냅니다.
3. 채워진 셀을 이미지화합니다.
   참고: 이미징은 주입 직후 수행할 수 있습니다. 더 높은 개구수(NA)를 가진 대물렌즈는 더 나은 해상도를 제공합니다.
   1. 세포가 원래 형태로 돌아올 때까지 기다렸다가 40x 대물렌즈로 이미징(15-20분)합니다. 세포를 이미지화하려면 컨포칼의 설정을 조정하여 더 미세한 가지와 프로세스가 정의된 것처럼 보이도록 합니다.
   2. 0.3μm의 단계 크기로 z-스택을 설정합니다. 이미징하는 동안 세포에서 신호가 없을 때까지 대물렌즈를 이동하고 이를 맨 위로 설정합니다. 그런 다음 신호가 없을 때까지 대물렌즈를 아래로(셀을 통해 초점) 이동하고 이를 아래쪽으로 설정합니다.

재료