일주기 시계 뉴런의 타임랩스 이미징을 위한 매트릭스에 초파리 뇌 내장(Embedding Drosophila Brain in a Matrix for Time-Lapse Imaging of the Circadian Clock Neurons)

초록

출처: Sabado, V., et al., Nagoshi, E. 초파리 애벌레 뇌의 일주기 시계의 단일 세포 해상도 형광 라이브 이미징 문화. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 초파리 뇌를 섬유소 매트릭스에 삽입한 다음 일주기 시계 뉴런의 저속 형광 이미징을 통해 명/암 주기와 동기화된 리듬 활동을 분석하는 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 3D 매트릭스에 뇌 이식 및 장착 (~ 20 분).
   1. 해부된 뇌를 피브리노겐 작업 용액(피브리노겐 최종 농도 ~3.3 mg/mL, 뇌당 10.5 μL)에 다음과 같이 담그십시오.
   2. 3.5μL의 슈나이더 활성 매체(SAM)/항생제를 흡인합니다. 팁에 SAM/항생제 배지를 분배하지 않고 해부에서 절개된 뇌를 동일한 피펫 팁으로 흡인합니다.
   3. 멸균 페트리 접시의 뚜껑에 뇌와 매체를 분배합니다. 뇌가 들어 있는 방울에 SAM/항생제 3.5μL와 따뜻한 피브리노겐/SAM 10mg/mL 용액 3.5μL를 추가합니다. 20 μL 피펫 팁으로 피펫팅하여 뇌 주위에 용액을 부드럽게 혼합합니다.
      참고: 이 단계에서 집게 대신 피펫을 사용하면 뇌에 스트레스를 주지 않습니다.
   4. 방울에서 피브리노겐 작용 용액 2μL를 취하여 유리 바닥 접시의 커버슬립에 작은 원으로 바릅니다. 0.8μL의 트롬빈을 첨가하고 피펫 팁으로 매우 빠르게 혼합합니다. 피브리노겐은 피브린으로 전환되어 중합을 시작합니다.
   5. 피브리노겐 작업 솔루션(step 1.1) 한 쌍의 집게 사이에 놓고 피브린의 흰색 매트릭스가 보이면 매트릭스에 배치합니다. 뇌의 앞쪽을 아래로 향하게 합니다(시계 뉴런을 이미징하기 위해). 커버 유리에 최대한 가깝게 누릅니다. 피브린 응고는 피브린층으로 구성되어 있습니다. 하나의 층을 선택하고 매트릭스를 분리하지 않고 작고 부드러운 움직임으로 뇌 위에 접습니다.
      1. 뇌를 안정시키기 위해 혈전의 다른 부분에서 2-3회 반복합니다.
         참고: 겸자로 뇌를 다룰 때는 뇌를 건조하게 하거나 신체적 스트레스를 가하지 않도록 주의한다.
   6. 트롬빈의 작용을 멈추기 위해 내장된 뇌 위에 20μL의 SAM/항생제를 첨가합니다.
   7. 절차를 반복하여 나머지 뇌를 마운트합니다. 최대 5-6개의 뇌를 유리 바닥 접시에 내장할 수 있습니다.
   8. 장기 라이브 이미징을 위해 내부 웰(유리 부분)에 600μL의 SAM/항생제를 추가합니다. 매체 위에 미리 절단된 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인을 놓고 바닥의 플라스틱 부분에 도포된 진공 그리스에 붙입니다(그림 1A).

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655	실험실에 있는 것과 정확히 같은지 확신할 수 없습니다. 가능할 때마다 "곤충 세포 배양에 적합"을 선택했습니다
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	230391
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
D-(+) Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
효모 추출물	Sigma-Aldrich	Y1000
Insulin	Sigma-Aldrich	I0516-5ML
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
BIS-TRIS	Sigma-Aldrich	B4429
L-(-)-말산	Sigma-Aldrich	M7397
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T0167
숙신산	Sigma-Aldrich	S9512
푸마르산	Sigma-Aldrich	F8509
α-케토글루타르산	Sigma-Aldrich	K1128
Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) 마이코플라즈마 및 바이러스 스크리닝	BioConcept Ltd. 아미메드	2-01F30-I
HEPES-KOH, pH 7.4	E&K Scientific Products	EK-654011
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S5011
Sucrose	Sigma-Aldrich	S7903
소 혈장에서 추출한 피브리노겐	Calbiochem (Merck)	341573-1GM	주의: 흡입, 피부 접촉 또는 삼키면 유해합니다. 층류 아래에서 조작
소 플라즈마의 트롬빈	Sigma-Aldrich	T9549	주의: 건강 위험, 장갑 사용
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Vaccum grease	Sigma-Aldrich	18405
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