마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입 시각화(Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons derived from Mouse Embryos)

초록

출처: Bancroft, E. A., et al. 1차 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적 Ca²⁺ 플럭스와 그 하류 효과를 정량화합니다. J. Vis. Exp. (2020)

{{TAG_ 46}}이 비디오는 마우스 배아에서 유래한 복부 중뇌 뉴런의 칼슘 유입을 실시간으로 시각화하는 방법을 보여줍니다. 칼슘 지표(calcium indicator)를 발현하기 위해 바이러스 벡터를 사용하여 컨포칼 현미경으로 뉴런을 이미지화하여 자발적 및 신경전달물질에 의한 칼슘 활동 중 형광 강도의 변화를 추적합니다.

프로토콜

1. 세포

도금참고: 경험에 비추어 볼 때, 배아 당 약 100,000개의 생존 가능한 세포가 수집됩니다. 2-3개월 된 시간 제한 임신 마우스는 일반적으로 8-10개의 배아 크기를 가지고 있습니다. 따라서 시간 제한 임신 마우스 당 총 세포 수율에 대한 대략적인 추정치는 약 100만 개의 세포입니다.

1. 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행한 다음 세포 배양 배지를 사용하여 현탁액을 2,000 cells/μL로 희석합니다. 간단히 섞습니다.
2. 인큐베이터에서 라미닌 용액이 든 커버슬립을 제거하고 진공 청소기를 사용하여 코팅된 커버슬립에서 남은 라미닌 용액을 흡인합니다. 커버슬립이 완전히 건조되지 않도록 빠르게 플레이트합니다. 각 커버슬립에 100μL(2.0 x 10⁵셀/커버슬립)를 피펫팅하고 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
35 mm uncoated plastic cell culture dish	VWR	25382-348-348
광섬유 조명기, 100V	Kent Scientific	KSC5410	<
VWR	28199-764<
Fluoview 1000 컨포칼 현미경	Olympus
Fluoview 1200 컨포칼 현미경	Olympus
Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x	ThermoFisher	14175095	500 mL
HEPES	VWR	101170-478<
HeraCell 150 CO₂ incubator	헤레우스 (ThermoFisher)
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020
L-글루탐산	VWR	97061-634
염화마그네슘 (MgCl₂), andydrous	Sigma-Aldrich	M8266
MPII 미니 연동 펌프, 115/230 VAC, 50/60 Hz	Harvard Apparatus	70-2027
pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	Addgene	100837-AAV1	Titer: 1.00E+13 gc/ml
염화칼륨(KCl), 무수	sigma-aldrich	746436
MPII용 펌프 헤드 튜빙 조각	Harvard Apparatus	55-4148
염화나트륨(NaCl), 무수	Sigma-Aldrich	746398
임신 여성 C57BL/6 마우스	Texas A&M Institue for Genomic Medicine

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