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1. 세포
도금참고: 경험에 비추어 볼 때, 배아 당 약 100,000개의 생존 가능한 세포가 수집됩니다. 2-3개월 된 시간 제한 임신 마우스는 일반적으로 8-10개의 배아 크기를 가지고 있습니다. 따라서 시간 제한 임신 마우스 당 총 세포 수율에 대한 대략적인 추정치는 약 100만 개의 세포입니다.
- 혈구계를 사용하여 세포 계수를 수행한 다음 세포 배양 배지를 사용하여 현탁액을 2,000 cells/μL로 희석합니다. 간단히 섞습니다.
- 인큐베이터에서 라미닌 용액이 든 커버슬립을 제거하고 진공 청소기를 사용하여 코팅된 커버슬립에서 남은 라미닌 용액을 흡인합니다. 커버슬립이 완전히 건조되지 않도록 빠르게 플레이트합니다. 각 커버슬립에 100μL(2.0 x 105셀/커버슬립)를 피펫팅하고 페트리 접시를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
- 각 접시에 세포 배양 배지 3mL를 조심스럽게 추가하고 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 프리폼 하프 미디엄은 2주 동안 일주일에 2회 교체합니다.
2. adeno-associated viral (AAV) vectors를 사용한 14(시험관 일) DIV의 세포 배양 감염
각 요리에 대해 1μL의 hSyn-GCaMP6f AAV(1.0 x 1013 titer)와 함께 1mL의 무혈청 DMEM 배지를 준비합니다각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고 hSyn-GCaMP6f가 함유된 무혈청 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 1mL로 교체합니다. 접시를 37°C 인큐베이터에 다시 1시간 동안 넣습니다.AAVs를 함유한 무혈청 배지를 흡인하고 3mL의 세포 배양 배지로 교체하십시오. 접시를 37 °C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 우리는 AAV 감염 5-7일이 이상적인 수준의 GCaMP 발현을 허용한다는 것을 발견했습니다. 이 바이러스 감염 기간 동안 2-3일마다 배지를 계속 교체하십시오.3. 19-21일 사이의 라이브 컨포칼 Ca2+ 이미징 in vitro (DIV)
참고: 이미징은 바이러스 감염 후 5-7일 사이에 수행할 수 있습니다. 이것은 자발적인 Ca2+ 활성을 검출할 수 있는 수준에서 형광단의 가시적인 발현을 달성하기 위한 이상적인 창입니다.
- Preparation of recording
- buffers 1L의 HEPES 기록 버퍼를 만들려면 NaCl 9.009g, KCl 0.3728g, D-포도당 0.901g, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) 2.381g, 1M CaCl2 원액 2mL 및 1M MgCl2 원액 500μL를 멸균 증류 H2 800mL에 추가합니다.O. NaOH로 pH를 7.4로 가져옵니다. 1L의 최종 부피로 가져옵니다.
- 200mL의 20μM 글루타메이트 기록 버퍼를 만들려면 40μL의 100mM 글루타메이트 원액을 위에서 설명한 200mL의 HEPES 기록 버퍼로 희석합니다.
- Confocal imaging
- 멸균 35mm 페트리 접시에 3mL의 기록 버퍼를 채웁니다.
- 37°C 인큐베이터에서 감염된 배양액이 있는 35mm 페트리 접시를 제거합니다. 가는 팁 집게를 사용하여 하나의 커버슬립 가장자리를 조심스럽게 잡고 녹음 버퍼로 채워진 페트리 접시에 빠르게 옮깁니다. 매체에 남아 있는 커버슬립을 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다. 기록 버퍼가 있는 접시를 컨포칼 현미경으로 운반합니다.
- 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화되는 동안 다음 단계를 진행합니다.
- 연동 펌프를 시작하고 라인을 녹음 버퍼에 넣습니다. 유속을 2mL/분으로 보정합니다.
- 35mm 페트리 접시에서 감염된 커버슬립을 기록 수조로 옮깁니다.
- 10x Water immersion objective와 bright-field(BF) 빛을 사용하여 초점면을 찾고 뉴런 세포체의 밀도가 높은 영역을 찾습니다. 40x 침수 대물렌즈로 전환하고 BF 조명을 사용하여 샘플의 초점을 다시 맞춥니다.
- FluoView의 "염료 목록" 창에서 AlexaFluor 488을 선택하고 적용합니다.
- AAV 표현은 가변적일 수 있습니다. 따라서 형광단의 과다 노출 및 광표백을 방지하기 위해 낮은 HV 및 레이저 출력 설정으로 시작하십시오. AlexaFluor 488 채널의 경우 고전압(HV)을 500으로, 게인을 1x로, 오프셋을 0으로 설정합니다. 488 레이저 라인의 경우 출력을 5%로 설정합니다. z-평면에서 이미징된 유효 부피를 늘리려면 핀홀 크기를 300μm로 늘립니다. "focus x2" 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 저포화 수준으로 최적으로 조정할 수 있습니다. 여기에서 각 채널의 이상적인 가시성이 확보될 때까지 설정을 조정할 수 있습니다.
참고: GCaMP로 Ca2+ 플럭스의 전체 범위를 정확하게 캡처하려면 검출기를 과포화시키지 않고 형광 강도를 증가시킬 수 있도록 기준선 HV 및 레이저 출력 설정을 조정하십시오. - 현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 나타내는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 초점을 맞춥니다.
- Interval" 창을 1.0 값으로 설정하고 "Num" 창을 600으로 설정합니다.
참고: 원하는 시점(300초)에 다른 기록 버퍼를 전달하려면 펌프의 대기 시간을 보정하여 새로운 솔루션을 수조에 전달하는 것이 중요합니다. 이는 용액 관류 속도(2mL/분)와 용액을 펌핑하는 데 사용되는 라인의 길이에 따라 달라집니다. - t 시리즈 동영상을 캡처하려면 "시간" 옵션을 선택한 다음 "XYt" 스캐닝 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다.
- 이미징이 완료되면 시리즈 완료 버튼을 선택하고 완성된 t-시리즈 동영상을 저장합니다. 추가로 5분 동안 20μM 글루타메이트를 계속 관류하여 배양된 뉴런이 총 10분 동안 글루타메이트에 노출되도록 합니다. 이미징할 각 커버슬립에 대해 이 프로세스를 반복합니다.
- 20μM 글루타메이트에 5분 더 노출된 후 수조에서 커버슬립을 제거하고 이미징이 완료될 때까지 기록 버퍼가 들어 있는 35mm 페트리 접시에 다시 넣습니다.