In Vitro Calcium Imaging in Short-Term and Long-Term Rat Hippocampal Cultures

초록

출처: Calvo-Rodríguez, et al. 노화된 해마 뉴런에서 세포 내 Ca²⁺의 형광 및 생물 발광 이미징.J. Vis. Exp. (2015).

이 비디오는 단기 및 장기 쥐 해마 배양에서 세포질 칼슘 수치를 측정하기 위해 형광 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 젊은 뉴런과 노화된 뉴런을 비교함으로써, 노화된 뉴런의 증가된 L형 전위의존성 칼슘 채널 밀도와 장기간의 활성화가 어떻게 뉴런 노화의 특징인 칼슘 과부하를 초래하는지 강조합니다. 형광 칼슘 지표는 자극에 따른 형광 강도의 변화를 통해 이러한 차이를 나타냅니다.

프로토콜

1. 쥐 해마 뉴런의 단기 및 장기 문화

1. 폴리-D-라이신 코팅, 12mm 유리 커버슬립의 준비.
   1. 12mm 직경의 유리 커버슬립을 에탄올로 최소 24시간 동안 살균하십시오. 멸균 상태에서 건조시키십시오.
   2. 페트리 접시에 있는 파라필름 스트립에 커버슬립을 배포합니다. 각 커버슬립의 표면을 200μl의 1mg/ml 폴리-D-라이신으로 덮습니다. 하룻밤 동안 치료할 수 있습니다(O/N).
   3. 다음날 멸균 상태에서 15분 동안 90분마다 이중 증류수 멸균수로 커버슬립을 세척합니다.
   4. 웰당 500μl의 Neurobasal Culture Medium으로 4웰 멀티디쉬 플레이트를 채웁니다. Neurobasal Culture Medium에는 10% 소 태아 혈청, 2% B27, 1μg/ml 겐타마이신 및 2mM L-글루타민이 보충되어야 합니다.
   5. 여러 접시 접시에 커버 슬립을 놓습니다. 가습 된 37ºC 및 5 % CO₂ 사용할 때까지 인큐베이터.
2. 신생아 쥐에서 해마 뉴런의 분리.
   1. 멸균 조건에서 바이알(20μl/ml)에 1.8ml 파파인 용액(직접 구매)을 준비합니다.20μl/ml의 최종 농도를 얻으려면 1.8ml Hank's와 0.6% 소 혈청 알부민에 약 40μl 파파인을 추가합니다(BSA, μl는 공급업체 조건에 따라 계산해야 함). Hank의 0.6% BSA는 85ml의 Hanks' Balanced Salt Solution(HBSS) 배지와 15ml의 4% 소 혈청 알부민(BSA, 100ml HBSS에 4g의 BSA를 용해하여 준비됨)을 혼합하여 제조됩니다. 멸균 후드에 준비하십시오.
   2. 사용하기 전에 Hank's와 0.6% BSA에 파파인을 30분 동안 배양합니다. 사용하기 전에 0.22μm 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
   3. Dulbecco의 Modified Eagle's Medium 분말(L당 13.5g)을 이중 증류 멸균수 900ml에 첨가하여 Ham's F-12 배지를 준비합니다. 그런 다음 6g 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 및 336mg NaHCO를 추가합니다₃하고 7.42로 조정합니다.멸균수를 추가하여 1L 용액을 얻고 0.20μm 폴리에테르설폰(PES) 병탑 필터를 사용하여 여과합니다. 이 과정을 멸균 후드에 넣어 운반하십시오. 마지막으로 CO₂하십시오. 용액을 4ºC에서 보관하고 냉장 보관하십시오.
   4. 갓 태어난 새끼(P0) 쥐를 참수하여 안락사시키고 머리를 멸균 HBS 배지로 씻습니다. 멸균 가위를 사용하여 두개골을 엽니 다. 주걱으로 뇌를 추출하고 Ham의 F-12 배지로 빠르게 씻습니다.
   5. 각 반구에서 메스를 사용하여 대각선으로 자르십시오 (Figure 1B) Ham의 F-12 매체가 들어있는 페트리 접시에 운반합니다.
   6. 수막은 해부 겸자를 사용하여 돋보기 아래에 조심스럽게 버리십시오.
   7. 돋보기를 사용하여 피질 위의 특징적인 오목한 위치에 있는 해마를 식별합니다. 그런 다음 한쪽 경계에서 조심스럽게 잡아당기고 눈 가위를 사용하여 제자리에서 제거하여 해마를 피질에서 분리합니다.
   8. 해마 조직을 Ca.style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ and Mg²⁺ 0.6% BSA를 더하고 해마 조직을 세척합니다. 미디어를 제거하지 않고 동일한 눈 가위를 사용하여 조직을 작은 조각(약 2 x 2mm)으로 자릅니다.
   9. 해마 조각을 1.8ml의 사전 여과된 파파인 용액이 들어 있는 바이알에 옮깁니다. 그런 다음 37ºC에서 가끔 부드럽게 흔들어 배양합니다. 15분 후, 90μl의 DNase I 용액(50μg/ml 최종)을 추가하고 15분 더 배양합니다.
   10. 조직을 10ml 원심분리 튜브에 옮기고 새로운 Neurobasal Culture Medium으로 조각을 씻습니다. 5ml 플라스틱 피펫에 조직 조각을 통과시켜 세포 현탁액을 얻습니다.
   11. 160 x g에서 5분 동안 원심분리기 셀 현탁액. 플라스틱 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 상등액을 제거하고 1ml의 Neurobasal Culture Medium에 1ml 자동 피펫으로 펠렛을 조심스럽게 현탁시킵니다.
   12. Neubauer 계수 챔버를 사용하여 세포 밀도를 측정합니다. Neubauer 챔버 위에 유리 커버슬립을 놓습니다. 10μl의 세포 현탁액을 추가합니다. 세포 현탁액이 챔버에 균일하게 들어가고 기포가 발생하지 않는지 확인하십시오. 현미경으로 관찰한 세포의 수를 세고 해당 계산을 수행하여 30 x 10<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>³ 셀. 세포의 총 수는 사용 된 동물의 수에 따라 다릅니다.
3. 쥐 해마 뉴런의 단기 및 장기 배양.
   1. 500μl의 Neurobasal Culture Medium을 함유한 4웰 멀티디쉬 플레이트 위에 약 30 x 10³ 세포를 1개의 poly-D-lysine 코팅된 12mm 직경의 유리 커버슬립을 포함하는 멀티디쉬 플레이트의 각 웰에 약 50μl의 드롭으로 합니다.
   2. 가습 된 37ºC 및 5 % CO<에서 기본 해마 세포를 유지하십시오 style='font-family : Arial, sans-serif; font-size : 0.6em; font-style : normal; font-variant : normal; font-weight : 400; text-decoration : none; vertical-align : baseline; white-space : pre-wrap; '>₂2-5 일 동안 인큐베이터 in vitro(DIV, 단기, 젊은 배양) 또는 >15 DIV(장기, 노화된 배양).

2. Cytosolic Ca의 형광 이미징²⁺ 농도

1. 형광 이미징을 위한 테스트 솔루션 준비.
   1. mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 개 1, CaCl₂ 1, 포도당 10, 나트륨-HEPES 10(pH 7.42).
   2. 외부 준비, Mg²⁺-free, HEPES 버퍼링 식염수(HBS) 용액 mM 포함 : NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, 포도당 10 및 HEPES 10 (pH 7.42).
   3. Mg²⁺ 없는 HEPES 완충 식염수(HBS)를 선택하고 10μM 글리신을 보충합니다.
   4. (mM 단위)를 풀어 NaCl 대신 KCl을 포함하는 HBS 솔루션을 준비합니다. KCl 145, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, 포도당 10 및 HEPES 10(pH 7.42).
2. 형광 칼슘 프로브 fura2/AM을 사용한 해마 세포의 로딩.
   1. 커버슬립이 포함된 세포 배양액을 인큐베이터에서 꺼내 웰당 500μl의 HBS를 포함하는 새로운 4웰 멀티디쉬 플레이트로 옮겨 실온(RT)에서 HBS 배지로 세척합니다.
   2. 어두운 곳에서 RT(25ºC)에서 60분 동안 fura2/AM 4μM(동일한 HBS 배지에서 준비)로 세포를 배양합니다.
   3. 60분 후 새 HBS 배지로 커버슬립을 세척합니다.
3. 배양 세포에서 cytosolic [Ca²⁺] 배양 세포에서.
   1. 램프, 현미경, 관류 시스템, 형광 카메라 및 컴퓨터를 켭니다.
   2. 12mm 유리 커버슬립을 열 수 있도록 온도 조절 플랫폼에 커버슬립을 놓습니다.tage 도립 현미경의 및 40X 대물렌즈(오일, 개구수[NA]:1.3)를 사용하여 현미경 필드를 선택합니다. 테스트 물질이 없거나 없는 경우 예열된(37ºC) HBS 배지로 셀을 지속적으로 관류합니다. 약 5-10ml/분의 속도로 흐름을 유지하십시오.
      참고: 세포 관류 시스템은 개방형 12mm 유리 커버슬립을 위한 온도 조절 플랫폼에 장착됩니다. 밸브 컨트롤러가 장착된 8라인 중력 구동 관류 시스템은 용액을 관류하는 데 사용됩니다. 진공 펌프는 과도한 매체를 제거하는 역할을 합니다. 용액은 튜브 내 가열 시스템을 사용하여 가열됩니다.
   3. 두 여기 파장에서 셔터를 닫은 상태에서 배경 이미지를 캡처합니다.
   4. 340 및 380 nm에서 세포를 교대로 에피 조명합니다. 형광 카메라로 5-10초마다 520nm에서 방출되는 빛을 fura-2 다이크로익 미러로 필터링합니다.
   5. 기록 기간이 끝나면 추가 분석을 위해 520nm에서 방출된 이미지의 전체 시퀀스를 컴퓨터에 저장합니다.
4. 기록된 형광 이미지 분석.
   1. 실험 파일을 엽니다. aquacosmos 소프트웨어를 사용하여 '비율'을 클릭하고 원하는 비율 범위를 선택합니다. 비율 이미지의 시퀀스를 얻기 위해 결과 이미지의 픽셀별 비율을 계산합니다.
   2. '배경 제거'를 조정하여 배경을 뺍니다. '계산 시작'을 누릅니다.
   3. '모든 시간 순서' 버튼을 누르고 고대 관심 영역(ROI)을 지웁니다. 개별 세포의 정량 분석을 위해 개별 뉴런에 해당하는 새로운 관심 영역 또는 ROI를 설정할 수 있습니다. 각 ROI와 각 이미지에 해당하는 각 픽셀의 모든 비율 값을 평균화하여 개별 ROI(세포)에 대한 비율 형광 값을 기록합니다.
   4. 개별 기록을 그래프로 표시하려면 각 ROI에 해당하는 비율 형광 값을 그래프 프로그램으로 내보냅니다.
   5. 적절한 데이터 분석 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 각 자극에 대한 반응으로 비율 형광의 상승 크기를 추정하기 위한 해당 계산을 수행합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049	<
HBSS 매체	Gibco	14170-088<
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032<
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
페트리 접시	JD 카탈루냐어 sl.	2120044T	<
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER 형광 카메라	hamamatsu
VC-8 밸브 컨트롤러	Warner Instruments
SH-27B 가열 시스템	Warner Instruments		<
Aquacosmos Software	하마마츠 포토닉스

tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> <tr style='height:20px;'>td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> tr style='height:20px;'>tr style='height:21px;'>