동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리위원회와 JoVE 수의사에 의해 검토되었습니다. 검토 게시판.
1. 동물의 관류
- 정착성 및 관류 완충액을 준비합니다.
- 염화나트륨(NaCl) 80g, 염화칼륨(KCl) 2g, 인산수소이나트륨 21.7g(Na2HPO4·7H2O), 2.59 g 인산이수소칼륨(KH2PO4), 그리고 이중 증류수를 사용하여 총 1L를 만듭니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
- 40g을 인산염 완충 식염수(PBS) 1L(0.1M, pH 7.4)에 추가합니다.
- PFA 용액을 60-65 °C로 가열하고 자석 교반기를 사용하여 혼합합니다.
참고: 온도는 65 °C를 초과해서는 안 됩니다. - 점적기로 수산화 나트륨 (NaOH) (1 N) 몇 방울을 첨가하여 PFA를 완전히 용해시킵니다.
- PFA 용액을 중간에서 미세한 여과지로 여과하고 4°C에서 보관하십시오.
참고: 해결책은 한 달 동안 좋습니다.
- 동물 마취 및 관류를 수행합니다.
참고: 12개월 된 B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x 가족성 알츠하이머병 (5×FAD)) 연령 일치 대조군 마우스(그룹당 n = 6)는 공급업체에서 구입하여 Saginaw Valley State University의 동물 집에서 사육되었습니다. 유전형 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 확인되었다. Human 알츠하이머병 (AD) 뇌 조직에는 사후 AD 뇌 조직과 연령에 맞는 대조 조직이 포함됩니다.- 펜토바르비탈나트륨(체중 390mg/kg) 또는 케타민/자일라진 혼합물(체중 80mg/kg 케타민 및 체중 10mg/kg 자일라진)과 같은 적절한 마취제로 동물을 마취합니다. 발가락을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오. 동물이 반응이 없으면 관류 수술을 받을 준비가 된 것입니다.
- 마취된 동물을 관류 수술 트레이에 누운 자세로 놓고 작은 홍채 가위를 사용하여 좌심실 뒤쪽 끝을 절개합니다.
- 22G 관류 바늘을 좌심실에 삽입하고 오른쪽 귓바퀴를 작게 절개하여 몸에서 관류액을 제거합니다. 중력 공급 관류 시스템을 사용하여 얼음처럼 차가운 관류 유체(0.1M PBS, pH 7.4)가 5-6분(유속 20-25ml/분) 동안 흐르도록 합니다.
참고: 지우기 간은 최적의 관류를 나타내는 지표입니다. - 버퍼 밸브를 고정을 위해 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환하고 8-10분 동안 흐르게 합니다.
참고: 것은 좋은 고정의 지표입니다. - 가위를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 주걱을 사용하여 뇌를 채취하여 4% PFA(뇌 부피의 10배 이상)가 든 바이알에 넣고 나중에 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.
2. 조직 처리
- 저온 유지 장치 절편을 자릅니다.
- 뇌를 등급이 매겨진 자당 용액(10%, 20%, 30%)으로 옮기고 사용할 때까지 각각 24시간 동안 4°C에서 보관합니다.
- -22°C에서 저온 유지 장치를 사용하여 40μm 두께의 절편을 절단합니다. PBS와 아지드화나트륨(0.02%)으로 채워진 6웰 플레이트에서 웰당 10-20개의 섹션을 수집합니다.
3. cur(curcumin) Aβ Aβ 플라크 및 올리고머의 항체.
- 2.1.2웰 플레이트에서 PBS 3x로 저온 유지 절편을 세척합니다.
- PBS에 용해된 10% 일반 염소 혈청(NGS)을 0.5% Triton-X-100으로 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
- 차단 용액을 폐기하십시오. 10% NGS 및 0.5% Triton-X100을 함유한 새로운 차단 용액에 용해된 아밀로이드-베타(Aβ) 특이적 항체(6E10 또는 A11, 희석 1:200)를 150rpm의 쉐이커에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 항체 용액을 버리고 PBS 3x로 각 10분 동안 절편을 세척합니다.
- 적색 형광단이 있는 2차 항체 태그로 배양합니다(예: Alexa
- 594) 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안.
- PBS로 3회씩 10회씩 세탁합니다.
- 70% 알코올로 1회 세척합니다.
- 실온에서 5분 동안 커큐민(Cur (10 μM))으로 절편을 배양합니다.
- 70% 알코올로 각각 3분씩 1회씩 세탁합니다.
- 90%와 100% 알코올로 각각 1분 동안 탈수하고, 크실렌 2배로 각각 5분 동안 세척하고, distyrene plasticizer xylene (DPX).
- 적색 및 녹색 신호에 대한 적절한 여기/방출 필터가 있는 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다.
