Immunolabeling 및 Curcumin 염색을 통한 뇌 조직 절편의 아밀로이드-베타 플라크 이미징

초록

출처: Maiti, P. et. al.,. 천연 폴리페놀 커큐민을 사용한 뇌 조직의 아밀로이드 플라크 라벨링 및 이미징. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 면역 표지 및 커큐민 염색을 사용하여 뇌 조직 절편에서 아밀로이드-베타 플라크의 이미징 절차를 보여줍니다. 면역 표지는 아밀로이드-베타에 대한 특이성을 제공하는 반면, 커큐민은 시트가 풍부한 β 섬유에 선택적으로 결합하여 시각화를 향상시킵니다. 적색과 녹색 형광의 공동 국소화는 플라크의 존재를 확인합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리위원회와 JoVE 수의사에 의해 검토되었습니다. 검토 게시판.                                                                  

1. 동물의 관류

1. 정착성 및 관류 완충액을 준비합니다.
   1. 염화나트륨(NaCl) 80g, 염화칼륨(KCl) 2g, 인산수소이나트륨 21.7g(Na₂HPO₄·7H₂O), 2.59 g 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 그리고 이중 증류수를 사용하여 총 1L를 만듭니다.
   2. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
      1. 40g을 인산염 완충 식염수(PBS) 1L(0.1M, pH 7.4)에 추가합니다.
      2. PFA 용액을 60-65 °C로 가열하고 자석 교반기를 사용하여 혼합합니다.
         참고: 온도는 65 °C를 초과해서는 안 됩니다.
      3. 점적기로 수산화 나트륨 (NaOH) (1 N) 몇 방울을 첨가하여 PFA를 완전히 용해시킵니다.
      4. PFA 용액을 중간에서 미세한 여과지로 여과하고 4°C에서 보관하십시오.
         참고: 해결책은 한 달 동안 좋습니다.
2. 동물 마취 및 관류를 수행합니다.
   참고: 12개월 된 B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( 5x 가족성 알츠하이머병 (5×FAD)) 연령 일치 대조군 마우스(그룹당 n = 6)는 공급업체에서 구입하여 Saginaw Valley State University의 동물 집에서 사육되었습니다. 유전형 분석은 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의해 확인되었다. Human 알츠하이머병 (AD) 뇌 조직에는 사후 AD 뇌 조직과 연령에 맞는 대조 조직이 포함됩니다.
   1. 펜토바르비탈나트륨(체중 390mg/kg) 또는 케타민/자일라진 혼합물(체중 80mg/kg 케타민 및 체중 10mg/kg 자일라진)과 같은 적절한 마취제로 동물을 마취합니다. 발가락을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오. 동물이 반응이 없으면 관류 수술을 받을 준비가 된 것입니다.
   2. 마취된 동물을 관류 수술 트레이에 누운 자세로 놓고 작은 홍채 가위를 사용하여 좌심실 뒤쪽 끝을 절개합니다.
   3. 22G 관류 바늘을 좌심실에 삽입하고 오른쪽 귓바퀴를 작게 절개하여 몸에서 관류액을 제거합니다. 중력 공급 관류 시스템을 사용하여 얼음처럼 차가운 관류 유체(0.1M PBS, pH 7.4)가 5-6분(유속 20-25ml/분) 동안 흐르도록 합니다.
      참고: 지우기 간은 최적의 관류를 나타내는 지표입니다.
   4. 버퍼 밸브를 고정을 위해 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환하고 8-10분 동안 흐르게 합니다.
      참고: 것은 좋은 고정의 지표입니다.
   5. 가위를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 주걱을 사용하여 뇌를 채취하여 4% PFA(뇌 부피의 10배 이상)가 든 바이알에 넣고 나중에 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.

2. 조직 처리

1. 저온 유지 장치 절편을 자릅니다.
   1. 뇌를 등급이 매겨진 자당 용액(10%, 20%, 30%)으로 옮기고 사용할 때까지 각각 24시간 동안 4°C에서 보관합니다.
   2. -22°C에서 저온 유지 장치를 사용하여 40μm 두께의 절편을 절단합니다. PBS와 아지드화나트륨(0.02%)으로 채워진 6웰 플레이트에서 웰당 10-20개의 섹션을 수집합니다.

3. cur(curcumin) Aβ Aβ 플라크 및 올리고머의 항체.

1. 2.1.2웰 플레이트에서 PBS 3x로 저온 유지 절편을 세척합니다.
2. PBS에 용해된 10% 일반 염소 혈청(NGS)을 0.5% Triton-X-100으로 실온에서 1시간 동안 차단합니다.
3. 차단 용액을 폐기하십시오. 10% NGS 및 0.5% Triton-X100을 함유한 새로운 차단 용액에 용해된 아밀로이드-베타(Aβ) 특이적 항체(6E10 또는 A11, 희석 1:200)를 150rpm의 쉐이커에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
4. 항체 용액을 버리고 PBS 3x로 각 10분 동안 절편을 세척합니다.
5. 적색 형광단이 있는 2차 항체 태그로 배양합니다(예: Alexa
6. 594) 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안.
7. PBS로 3회씩 10회씩 세탁합니다.
8. 70% 알코올로 1회 세척합니다.
9. 실온에서 5분 동안 커큐민(Cur (10 μM))으로 절편을 배양합니다.
10. 70% 알코올로 각각 3분씩 1회씩 세탁합니다.
11. 90%와 100% 알코올로 각각 1분 동안 탈수하고, 크실렌 2배로 각각 5분 동안 세척하고, distyrene plasticizer xylene (DPX).
12. 적색 및 녹색 신호에 대한 적절한 여기/방출 필터가 있는 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다.

재료