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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
- 두개골 창 설치 후 2주 또는 그 이후에 이광자 형광 수명 이미징 현미경(2pFLIM) 이미징을 시작합니다. 마우스가 익숙해지도록 이미징 연구를 시작하기 전에 마우스를 자주 다루고 긁어 스트레스로 인한 실험적 간섭을 최소화합니다.
- 이광자 레이저를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 이광자 여기 레이저 파장을 960nm로 설정합니다.
- 4% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 꼬리를 꼬집어 적절한 마취를 확인하고 호흡 속도를 관찰합니다. 즉, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어야 하며 호흡 속도는 초당 ~1 호흡으로 줄여야 합니다. 불필요한 시술 시간을 최소화하고 마취 시간이 2-3분 정도만 지속되기 때문에 눈 윤활제를 사용하지 않습니다.
- 마취된 마우스를 전동 러닝머신으로 옮깁니다(그림 1C) 마우스의 헤드플레이트를 트레드밀 설정의 헤드플레이트 홀더에 장착합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'그림 1 자세한 내용은). 마우스의 두개골 창 커버슬립 표면을 70% 에탄올로 청소합니다.
- 장착된 마우스가 있는 전동 트레드밀을 2pFLIM 대물렌즈 아래에 놓습니다. 두개골 창 커버슬립과 대물렌즈 사이에 증류수 한 방울을 바르십시오.
- 장착된 마우스가 마취에서 깨어나 최소 10분 동안 트레드밀과 현미경 환경에 적응하도록 합니다. 장착된 마우스가 마취에서 깨어나는 동안 마우스의 호흡 속도를 모니터링합니다.
- 에피 조명 아래의 사출 주입점으로 이동합니다. 명시야 아래의 기준 특징(즉, 혈관)을 문서화하여 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역(ROI)의 이미징을 지원합니다.
- 뇌 조직에서 방출되는 빛 외에 들어오는 빛을 모두 제거합니다. 에피 조명 광원을 끄고 2pFLIM 리그의 인클로저를 닫습니다. 하드웨어 명령 vol을 켜서 2pFLIM PMT를 활성화합니다.tag전자 제어.
- 깨어 있는 마우스에서 tAKARα-positive somata를 이미징하기 위해 다음과 같은 권장 설정과 함께 2pFLIM 획득 소프트웨어 FLIMimage를 사용하여 z-stack 2pFLIM 이미지를 획득합니다. 프레임 평균을 3프레임으로, 스캔 속도를 2ms/라인으로, 이미지 크기를 128 x 128 픽셀로, 시야를 90−100 μm로 설정합니다. 준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다.
- FLIM 보기에서 획득한 이미지를 검사합니다(자체 개발한 맞춤형 소프트웨어). 1.9단계에 따라 이미징 설정을 조정하여 광자 수를 최적화하고 광표백을 최소화합니다.
참고: 생체 내에서 tAKARα-positive soma의 평생 이미징을 위한 ROI에서 실행 가능한 통합 광자 수는 특정 자극으로 인한 신호 진폭에 따라 ~1,000−10,000 광자입니다.
- 시야 감소, 스캔 속도 감소, 레이저 출력 증가 및 평균화할 프레임 수를 늘려 통합 광자 수를 늘리고 수명 추정 오류를 줄입니다. 동시에 최소한의 필수 레이저 출력, 프레임 평균화 및 스캔 속도를 사용하여 광표백을 최소화해야 합니다.
- 1.10단계에서 결정된 설정을 사용하여 z-stack 획득을 반복하여 일정한 시간 간격(예: 30-60초마다)으로 이미지를 제공합니다. 제로 트레드밀 속도에서 최소 15분 동안 기준선 2pFLIM 이미지를 획득합니다.
- 15pFLIM 이미지를 획득하면서 15분 동안 트레드밀 회전 속도를 ~2cm/s로 설정합니다. 트레드밀 회전을 끈 후 ≥20분 동안 이미징을 계속하여 강제 이동을 중단한 후 PKA 활동의 지속 시간을 평가합니다.
2. 2pFLIM 이미지 분석
1. FLIMview에서 획득한 이미지를 열고 FLIMview에서 다음 파라미터를 설정합니다.
1. FLIMview에서 단일 광자 계수(SPC) 최소 및 최대 범위 필드를 클릭합니다. 일반적으로 각각 1.2−2에서 10−12ns 사이의 적절한 최소 및 최대 SPC 범위 값을 입력합니다.
2. t를 클릭하십시오.0 값 필드를 FLIMview에 입력하고 t를 입력합니다.0 값(일반적으로 ~2ns). FLIMview에서 수명 휘도 최소 임계값 필드를 클릭하고 원하는 임계값을 5-30 광자에 입력합니다.
2. 새 그룹 버튼(N)을 선택하고 실험 그룹 이름을 할당합니다. 이렇게 하면 추가된 각 FLIM 이미지의 데이터를 결합하는 그룹이 생성됩니다.
3. 를 클릭합니다. ROI 버튼에 Roi Controls 모듈을 보고 tAKARα-positive soma 주위에 ROI를 그립니다. z-stack Control 슬라이더는 다른 z 깊이의 배경 광자에서 발생하는 신호 오염을 최소화합니다.
4. + 버튼을 클릭하여 FLIM 이미지를 그룹에 추가합니다(2.2단계). Calc 버튼을 눌러 ROI 및 수명 추정 오차(δτ)에 대한 평균 수명(LT, 평균 광자 방출 시간[MPET]이라고도 함)을 계산합니다.
5. 연대순 2pFLIM 이미징 시리즈의 다음 파일을 엽니다. 2.4단계를 반복합니다. 시간이 지남에 따라 조직 이동이 있을 수 있으므로 시간이 지남에 따라 동일한 tAKARα-양성 소마를 측정하기 위해 ROI 및 z-스택 범위의 위치를 조정해야 합니다.
6. 선택 deltaMPET/MPET0 그룹 컨트롤 모듈. baseline# 필드를 클릭하고 인덱스(예: 1 2 3 4 5 2.3단계에서 만든 그룹의 처음 5개 이미지에 대해). 이것은 기준선 수명을 계산하는 데 사용되는 이미지를 정의합니다 (LT0).
7. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Plot을 클릭하여 FLIM 응답(ΔLT/LT0) 정의된 ROI에서 실험하는 동안 tAKARα의 농도. 해당 기준선 수명에 의한 개별 ROI의 정규화된 수명(ΔLT) 변화(LT0) 서로 다른 ROI에서 이동 중 PKA 활동을 비교할 수 있습니다.
