Visualizing Protein Kinase: Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy를 사용한 마우스의 활성

초록

출처: Jongbloets, B. C., et al. Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-Fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy(생체 내 이광자 형광 수명 이미징 현미경을 사용한 머리 고정 동작 마우스의 활성) Protein Kinase A Activity. J. Vis. Exp. (2019)

이 비디오는 강제 이동 중 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나아제 A 활성을 시각화하기 위한 이광자 형광 수명 이미징 현미경 검사 절차를 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

1. 두개골 창 설치 후 2주 또는 그 이후에 이광자 형광 수명 이미징 현미경(2pFLIM) 이미징을 시작합니다. 마우스가 익숙해지도록 이미징 연구를 시작하기 전에 마우스를 자주 다루고 긁어 스트레스로 인한 실험적 간섭을 최소화합니다.
2. 이광자 레이저를 제어하는 소프트웨어를 사용하여 이광자 여기 레이저 파장을 960nm로 설정합니다.
3. 4% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 꼬리를 꼬집어 적절한 마취를 확인하고 호흡 속도를 관찰합니다. 즉, 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 없어야 하며 호흡 속도는 초당 ~1 호흡으로 줄여야 합니다. 불필요한 시술 시간을 최소화하고 마취 시간이 2-3분 정도만 지속되기 때문에 눈 윤활제를 사용하지 않습니다.
4. 마취된 마우스를 전동 러닝머신으로 옮깁니다(그림 1C) 마우스의 헤드플레이트를 트레드밀 설정의 헤드플레이트 홀더에 장착합니다(<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'그림 1 자세한 내용은). 마우스의 두개골 창 커버슬립 표면을 70% 에탄올로 청소합니다.
5. 장착된 마우스가 있는 전동 트레드밀을 2pFLIM 대물렌즈 아래에 놓습니다. 두개골 창 커버슬립과 대물렌즈 사이에 증류수 한 방울을 바르십시오.
6. 장착된 마우스가 마취에서 깨어나 최소 10분 동안 트레드밀과 현미경 환경에 적응하도록 합니다. 장착된 마우스가 마취에서 깨어나는 동안 마우스의 호흡 속도를 모니터링합니다.
7. 에피 조명 아래의 사출 주입점으로 이동합니다. 명시야 아래의 기준 특징(즉, 혈관)을 문서화하여 후속 이미징 세션 동안 동일한 관심 영역(ROI)의 이미징을 지원합니다.
8. 뇌 조직에서 방출되는 빛 외에 들어오는 빛을 모두 제거합니다. 에피 조명 광원을 끄고 2pFLIM 리그의 인클로저를 닫습니다. 하드웨어 명령 vol을 켜서 2pFLIM PMT를 활성화합니다.tag전자 제어.
9. 깨어 있는 마우스에서 tAKARα-positive somata를 이미징하기 위해 다음과 같은 권장 설정과 함께 2pFLIM 획득 소프트웨어 FLIMimage를 사용하여 z-stack 2pFLIM 이미지를 획득합니다. 프레임 평균을 3프레임으로, 스캔 속도를 2ms/라인으로, 이미지 크기를 128 x 128 픽셀로, 시야를 90−100 μm로 설정합니다. 준비 및 하드웨어 구성에 따라 이미징 설정을 조정합니다.
10. FLIM 보기에서 획득한 이미지를 검사합니다(자체 개발한 맞춤형 소프트웨어). 1.9단계에 따라 이미징 설정을 조정하여 광자 수를 최적화하고 광표백을 최소화합니다.

참고: 생체 내에서 tAKARα-positive soma의 평생 이미징을 위한 ROI에서 실행 가능한 통합 광자 수는 특정 자극으로 인한 신호 진폭에 따라 ~1,000−10,000 광자입니다.

1. 시야 감소, 스캔 속도 감소, 레이저 출력 증가 및 평균화할 프레임 수를 늘려 통합 광자 수를 늘리고 수명 추정 오류를 줄입니다. 동시에 최소한의 필수 레이저 출력, 프레임 평균화 및 스캔 속도를 사용하여 광표백을 최소화해야 합니다.
2. 1.10단계에서 결정된 설정을 사용하여 z-stack 획득을 반복하여 일정한 시간 간격(예: 30-60초마다)으로 이미지를 제공합니다. 제로 트레드밀 속도에서 최소 15분 동안 기준선 2pFLIM 이미지를 획득합니다.
3. 15pFLIM 이미지를 획득하면서 15분 동안 트레드밀 회전 속도를 ~2cm/s로 설정합니다. 트레드밀 회전을 끈 후 ≥20분 동안 이미징을 계속하여 강제 이동을 중단한 후 PKA 활동의 지속 시간을 평가합니다.
   

2. 2pFLIM 이미지 분석

1. FLIMview에서 획득한 이미지를 열고 FLIMview에서 다음 파라미터를 설정합니다.

1. FLIMview에서 단일 광자 계수(SPC) 최소 및 최대 범위 필드를 클릭합니다. 일반적으로 각각 1.2−2에서 10−12ns 사이의 적절한 최소 및 최대 SPC 범위 값을 입력합니다.

2. t를 클릭하십시오.₀ 값 필드를 FLIMview에 입력하고 t를 입력합니다.₀ 값(일반적으로 ~2ns). FLIMview에서 수명 휘도 최소 임계값 필드를 클릭하고 원하는 임계값을 5-30 광자에 입력합니다.

2. 새 그룹 버튼(N)을 선택하고 실험 그룹 이름을 할당합니다. 이렇게 하면 추가된 각 FLIM 이미지의 데이터를 결합하는 그룹이 생성됩니다.

3. 를 클릭합니다. ROI 버튼에 Roi Controls 모듈을 보고 tAKARα-positive soma 주위에 ROI를 그립니다. z-stack Control 슬라이더는 다른 z 깊이의 배경 광자에서 발생하는 신호 오염을 최소화합니다.

4. + 버튼을 클릭하여 FLIM 이미지를 그룹에 추가합니다(2.2단계). Calc 버튼을 눌러 ROI 및 수명 추정 오차(δτ)에 대한 평균 수명(LT, 평균 광자 방출 시간[MPET]이라고도 함)을 계산합니다.

5. 연대순 2pFLIM 이미징 시리즈의 다음 파일을 엽니다. 2.4단계를 반복합니다. 시간이 지남에 따라 조직 이동이 있을 수 있으므로 시간이 지남에 따라 동일한 tAKARα-양성 소마를 측정하기 위해 ROI 및 z-스택 범위의 위치를 조정해야 합니다.

6. 선택 deltaMPET/MPET₀ 그룹 컨트롤 모듈. baseline# 필드를 클릭하고 인덱스(예: 1 2 3 4 5 2.3단계에서 만든 그룹의 처음 5개 이미지에 대해). 이것은 기준선 수명을 계산하는 데 사용되는 이미지를 정의합니다 (LT₀).

7. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Plot을 클릭하여 FLIM 응답(ΔLT/LT₀) 정의된 ROI에서 실험하는 동안 tAKARα의 농도. 해당 기준선 수명에 의한 개별 ROI의 정규화된 수명(ΔLT) 변화(LT₀) 서로 다른 ROI에서 이동 중 PKA 활동을 비교할 수 있습니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Two-photon microscope	N/A	N/A
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A
FLIMview MATLAB software	N/A	N/A
16x 0.8 NA water-immersion objective	니콘	MRP07220
AnimalTracker MATLAB 소프트웨어	N/A	N/A
stereotaxic alignment systsem	David kopf	1900
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyntAKARα-WPRE)	addgene	119921
Headplate	N/A	N/A
Headplate holder	N/A	N/A
원형 커버 슬립 (직경 5mm)	101413-528

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