쥐 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 3차원 시각화

초록

출처: Zaeck, L., et al. 용매 세척 뇌 조직에서 광견병 바이러스 감염의 고해상도 3D 이미징. J. Vis. Exp. (2019).

이 비디오는 감염 진행을 평가하기 위해 광견병 바이러스(RABV)에 감염된 쥐의 뇌 조직을 준비하고 이미징하는 과정을 보여줍니다. 형광 마커를 사용한 조직 염색, 탈수, 투명화, 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 검사를 위한 장착을 포함한 주요 단계를 간략하게 설명하여 3차원 표현을 생성하는 것으로 마무리합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

RABV에 감염된 파라포름알데히드(PFA) 고정 보관된 뇌 물질이 사용되었습니다.

주의: 이 프로토콜은 다양한 독성 및/또는 유해 물질을 사용합니다. PFA, 메탄올(MeOH), 과산화수소(H₂O₂), 아지드화나트륨(NaN₃), tert-부탄올(TBA), 벤질 알코올(BA), 벤질 벤조에이트(BB) 및 디페닐 에테르(DPE). MeOH 및 TBA는 가연성이 높습니다. 적절한 개인 보호 장비(실험실 가운, 장갑 및 보안경)를 착용하고 흄 후드에서 실험을 수행하여 노출을 피하십시오. 폐기물을 적절한 용기에 별도로 수거하여 현지 규정에 따라 폐기하십시오. 광견병 바이러스는 생물안전성 수준(BSL)-2 병원체로 분류되므로 일반적으로 BSL-2 조건에서 처리할 수 있습니다. 에어로졸을 생성하거나, 높은 농도의 바이러스에서 작동하거나, 새로운 리사바이러스를 사용할 수 있는 절차를 포함한 일부 활동에는 BSL-3 분류가 필요할 수 있습니다. 동물 관리인 및 실험실 작업자를 포함한 고위험 인력에게는 노출 전 예방이 권장됩니다. 지역 당국 규정을 참조하십시오.

1. 뇌 조직의 고정 및 절편

1. {{}} 인산염 완충 식염수(PBS [pH 7.4])에 4% PFA의 적절한 부피로 뇌 샘플을 4°C에서 최소 48시간 동안 고정합니다(대략적인 조직 대 고정 비율 1:10 [v/v]).
2. 위치 조직 샘플을 PBS에서 3회 세척하고, 세척할 때마다 최소 30분 동안 세척하고 0.02% NaN₃/PBS에 보관합니다.
3. 비브라톰을 사용하여 조직을 1mm 두께의 섹션으로 절단합니다(블레이드 이송 속도: 0.3–0.5mm/s, 진폭: 1mm, 슬라이스 두께: 1,000μm).
4. 올바른 절편 염기서열을 유지하려면 각 조직 절편을 멀티웰 세포 배양 플레이트의 웰에 별도로 보관하십시오. 0.02% NaN₃/PBS를 첨가하고 조직 절편을 사용할 때까지 4°C에서 보관합니다.

2. 메탄올을 사용한 샘플 전처리

참고: 모든 배양 단계를 완만한 진동으로 수행하고, 달리 표시되지 않은 경우 실온에서 수행합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 샘플 전처리는 MeOH 및 H₂O₂에 노출되어 항체 확산을 개선하고 조직 자가형광을 감소시키는 전반적인 목적을 제공합니다.

1. 증류수에 20%(v/v), 40%, 60% 및 80% MeOH 용액을 준비합니다. 예를 들어, 20% MeOH의 경우 적절한 밀봉 가능한 용기에 증류수 40mL에 100% MeOH 10mL를 첨가하고 반전하여 혼합합니다.
2. 샘플을 합리적인 크기의 용기(예: 5mL 반응 튜브)로 옮깁니다. 이 프로토콜에 사용된 시약에 화학적으로 내성이 있는 재료를 사용하도록 주의하십시오. 예를 들어, 폴리프로필렌은 적합하지만 폴리스티렌은 적합하지 않습니다.
   참고: 이 프로토콜의 부피 사양은 5mL 반응 튜브를 참조합니다. 다른 용기를 사용하는 경우 그에 따라 부피를 조정하십시오.
3. 준비된 일련의 MeOH 용액의 각 농도 4mL에서 샘플을 각각 1시간 동안 오름차순으로 배양합니다.
4. 샘플을 순수(100%) MeOH에서 각각 1시간 동안 2회 배양합니다.
5. 샘플을 4°C로 냉각합니다(예: 실험실용 냉장고).
6. 예를 들어 30% H_{2{{TAG_172 TAG_171 TAG_183}}}O{{TAG_173 TAG_175 TAG_188}}{{TAG_176 TAG_179}}2{{TAG_177 TAG_189}}{{}}를 1:6으로 희석하여 표백 용액(5% H{{TAG_170 TAG_169}}{{}}2{{}}{{}}{{}}O{{}}2{{}}을 희석하여 순수한(100%) MeOH를 넣고 4°C에서 냉각합니다.
7. 냉장 샘플에서 100% MeOH를 제거하고 미리 냉각된 표백 용액 4mL(5% H₂O₂ MeOH). 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
8. 표백 용액을 80% MeOH 4mL로 교환하고 1시간 동안 배양합니다. 샘플이 20% MeOH 4mL에서 1시간 동안 배양될 때까지 각각 1시간 동안 준비된 일련의 MeOH 용액을 내림차순으로 계속 사용합니다.
9. PBS 4mL로 샘플을 1시간 동안 1회 세척합니다.

3. 면역염색

참고: 모든 배양 단계를 부드러운 진동으로 수행하며, 달리 표시되지 않은 경우 실온에서 수행합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 미생물 성장을 방지하려면 NaN₃을 이 섹션의 용액에 최종 농도 0.02%로 추가합니다. 조직 샘플은 비이온성 세제인 Triton X-100 및 Tween 20으로 처리하여 더욱 투과화됩니다. 일반 혈청은 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 사용됩니다. 글리신(glycine)과 헤파린(heparin)을 첨가하여 면역 표지 배경을 줄입니다.

1. 샘플을 0.2% Triton X-100/PBS 4mL에 각각 1시간 동안 2회 세척합니다.
2. 37°C에서 4mL의 0.2% Triton X-100/20% dimethyl sulfoxide(DMSO)/0.3M glycine/PBS로 샘플을 2일 동안 투과합니다.
3. 0.2% Triton X-100/10% DMSO/6% normal serum/PBS 4 mL에 시료를 37°C에서 2일 동안 배양하여 항체의 비특이적 결합을 차단합니다.
   참고: 이상적인 차단 결과를 얻으려면 2차 항체가 생성된 동일한 종의 일반 혈청을 사용하십시오.
4. 2mL의 1차 항체 용액(3% 일반 혈청/5% DMSO/PTwH[헤파린이 포함된 PBS-Tween 20] + 1차 항체/항체)에 샘플을 37°C에서 5일 동안 배양합니다. 2.5일 후에 1차 항체 용액을 새로 고칩니다.
   1. PTwH의 경우 증류수에 헤파린 나트륨 염을 재구성하여 10mg/mL 원액을 만듭니다(이 용액을 분주하여 4°C에서 보관). 원액을 0.2% Tween 20/PBS에 최종 농도 10μg/mL로 추가합니다.
      참고: 올바른 항체 희석을 선택하려면 최적화가 필요할 수 있습니다. 일반적으로 표준 면역조직화학 농도는 좋은 시작점입니다.
5. PTwH 4mL로 1일 동안 샘플을 세척하고, 낮에는 세척 버퍼를 최소 4-5회 교체하고 최종 세척은 밤새 그대로 둡니다. 위치
6. 2mL의 2차 항체 용액(3% 일반 혈청/PTwH + 2차 항체/항체)에 샘플을 37°C에서 5일 동안 배양합니다. 2.5일 후에 2차 항체 용액을 새로 고칩니다.
   1. 2차 항체/항체를 1:500으로 2차 항체 용액(즉, 2mL 중 4μL)으로 희석합니다.
7. 3.5단계에서 설명한 대로 1일 동안 샘플을 세척하고 최종 세척을 밤새 그대로 둡니다.

4. 핵 염색

참고: 모든 배양 단계를 부드러운 진동으로 수행하며, 달리 표시되지 않은 경우 실온에서 수행합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 핵 염색이 필요하지 않거나 다른 형광단의 여기 또는 검출을 위해 thiazole Red(TO-PRO-3)의 여기 파장/방출 스펙트럼이 필요한 경우 이 단계를 건너뜁니다.

1. 핵산 염색 TO-PRO-3를 PTwH에서 1:1,000으로 희석하고 샘플을 4mL의 핵 염색 용액에 5시간 동안 배양합니다.
2. 3.5단계에서 설명한 대로 1일 동안 샘플을 세척하고 최종 세척을 밤새 둡니다.
   참고: 세척 후 샘플은 광학 정화까지 4°C의 PBS에 보관할 수 있습니다.

5. 조직 청소

참고: 모든 배양 단계를 부드러운 진동으로 수행하고, 달리 표시되지 않은 경우 실온에서 수행합니다. 빛으로부터 샘플을 보호하십시오. 조직 샘플은 등급이 매겨진 일련의 TBA 용액에서 탈수됩니다. 면역염색에는 수용액이 필요하기 때문에 모든 염색 절차는 조직 세척 전에 완료해야 합니다. 광학 제거율 및 굴절률 일치는 BA, BB 및 DPE를 혼합하여 처리하여 달성됩니다. 클리어링 솔루션에는 항산화제로서 DL-α-토코페롤이 보충됩니다.

1. 증류수에 30%(v/v), 50%, 70%, 80%, 90% 및 96% TBA 용액을 준비합니다. 예를 들어, 30% TBA의 경우 적절한 밀봉 가능한 용기에 100% TBA 15mL를 증류수 35mL에 넣고 반전하여 혼합합니다.
   참고: TBA의 녹는점은 25–26 °C입니다. 따라서 실온에서 고체가 되는 경향이 있습니다. TBA 용액을 준비하려면 잘 밀봉된 병을 인큐베이터 또는 수조에서 37°C로 가열합니다.
2. 준비된 일련의 TBA 용액의 각 농도 4mL로 샘플을 각각 2시간 동안 오름차순으로 탈수합니다. 96% TBA를 하룻밤 사이에 두십시오.
3. 2시간 동안 순수(100%) TBA에서 샘플을 추가로 탈수합니다.
4. 투명화 용액 BABB-D15를 준비합니다.
   참고: BABB-D15는 BA와 BB(BABB)의 조합으로, x:1의 비율로 DPE와 혼합되며, 여기서 x는 솔루션 이름에 지정됩니다. 이 경우 15.
   1. BABB의 경우 1액 BA와 2액 BB를 혼합합니다.
   2. BABB와 DPE를 15:1의 비율로 혼합합니다.
   3. 0.4 vol% DL-α-토코페롤(비타민 E)을 첨가합니다.
      참고: 예를 들어, BABB-D15 20mL의 경우 BA 6.25mL와 BB 12.5mL를 혼합합니다. DPE 1.25mL를 추가하고 DL-α-토코페롤 0.08mL를 보충합니다.
5. 광학적 투명이 될 때까지(2–6시간) 투명 용액에서 샘플을 세척합니다.
6. 시료는 장착 및 이미징 전까지 빛으로부터 보호되는 BABB-D15에 4°C에서 보관할 수 있습니다.

6. 샘플 장착

1. 3D 프린터를 사용하여 이미징 챔버와 덮개(재료: 코폴리에스터[CPE], 노즐: 0.25mm, 층 높이: 0.06mm, 벽 두께: 0.88mm, 벽 수: 4, 충전재: 100%, 지지 구조 없음)를 인쇄합니다.
2. 이미징 챔버를 조립합니다(그림 1).
   1. RTV-1(일액형 실온 가황) 실리콘 고무로 이미징 챔버에 원형 커버슬립(직경: 30mm)을 장착합니다. 물에 적신 면봉으로 여분의 실리콘 고무를 제거하고 밤새 경화시킵니다.
   2. RTV-22 실리콘 고무로 뚜껑에 원형 커버슬립(직경: 1mm)을 장착합니다. 물에 적신 면봉으로 여분의 실리콘 고무를 제거하고 밤새 경화시킵니다. 위치
3. 샘플을 이미징 챔버에 넣고 소량의 BABB-D15를 첨가한 다음 뚜껑을 삽입합니다. 피하 주사 바늘(15G x 27/4인치[0.40mm x 20mm])을 사용하여 입구를 통해 챔버를 BABB-D20로 채웁니다.
4. 흡입구를 막고 RTV-1 실리콘 고무로 이미징 챔버를 밀봉합니다. 어둠 속에서 밤새 치료하십시오.

7. 이미징 및 이미지 처리

1. 사용된 형광단과 일치하는 각 레이저 라인을 선택하여 이미지 획득을 설정합니다. 채널 간의 신호 중복을 방지하기 위해 각 감지기의 감지 범위를 조정합니다.
   참고: TAG_546 TAG_545 TAG_544 Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 및 TO-PRO-3의 예시적인 감지 범위는 각각 500–550nm, 590–620nm 및 645–700nm입니다.
2. 획득 파라미터를 선택하고, z 스택의 위쪽 및 아래쪽 테두리를 정의하고, 이미지 스택을 획득합니다.
   참고: 예시적인 획득 매개변수는 픽셀 크기 60-90nm, z-step 크기 0.5μm, 라인 평균 1, 스캔 속도 400Hz, 핀홀 크기 1Airy 단위의 순차 스캔입니다.
3. 적절한 이미지 분석 소프트웨어(예: 피지)를 사용하여 이미지 스택을 처리하여 3D 프로젝션을 생성하거나 심층 분석을 수행합니다.
   참고: 획득한 이미지 파일의 크기가 크기 때문에 일반적으로 워크스테이션을 사용해야 합니다.
   1. 피지에서 획득 또는 이미지 파일을 엽니다(파일 |{ {TAG_589}} 열기 | 파일 선택).
      1. 예를 들어 LIF 파일을 사용하는 경우 Bio-Formats 대화 상자 창에서 원하는 옵션을 선택하거나 선택 취소합니다. 하이퍼스택이 있는 스택을 봅니다. 그 외에는 특정 선택이나 눈금이 필요하지 않습니다. 확인을 누릅니다.
      2. 파일에 여러 이미지 스택이 포함된 경우 분석할 이미지 스택을 선택하고 확인을 눌러 확인합니다.
   2. 병합된 이미지를 개별 채널로 분할하여 표백제 보정을 수행합니다(이미지 |{ {TAG_645}} 색상 | 채널 도구를 선택한 다음 더 보기 | {{TAG_663채널 분할)을 선택합니다. 각 채널에 대해 표백제 보정(이미지: TAG_672}}| 조정: | 블리치 보정)을 선택하고 단순 비율: (배경 강도: 0.0).
      참고: 예를 들어, 신호의 선형 감소가 없거나 신호가 전체적으로 너무 약한 경우 단순 비율이 실패할 수 있습니다. 또는 Exponential Fit을 시도하거나 표백제 보정을 건너뜁니다.
   3. 슬라이더를 사용하여 각 채널의 밝기와 대비를 조정합니다(이미지 |{ {TAG_724}} 조정 | 밝기 | 대비).
   4. 채널 병합 (이미지 |{ {TAG_754}} 색상 | 채널 병합), 합성(이미지 | 색상 | 채널 도구, 그런 다음 추가 | 합성 만들기)를 선택하고 RGB 형식으로 변환합니다(이미지 | 색상 | 채널 도구를 선택한 다음 더 보기 | RGB로 변환)을 선택합니다.
   5. 필요한 경우 이미지 스택의 크기를 조정하여 계산 시간과 파일 크기를 줄입니다(이미지 | {{TAG_838조정 | 크기{{TAG_847, 두 옵션 모두 선택되어 있고 bilinear interpolation이 있습니다).
   6. 3D 투영을 생성합니다(이미지 | 스택 | {{TAG_8683D 프로젝트). 프로젝션 방법으로 Brightest Point를 선택하고 획득한 이미지 스택의 z 단계 크기와 일치하도록 슬라이스 간격을 설정합니다. 품질을 극대화하려면 회전 각도 증가를 1로 설정하고 보간을 활성화합니다. 필요에 따라 전체 회전, 투명도 임계값 및 불투명도를 수정합니다.
   7. 필요한 경우 3D 프로젝션을 다시 8비트 형식으로 변환하여 대비와 밝기를 다시 조정합니다(이미지 | {{TAG_898유형 | 8비트). 해당 슬라이더(이미지 | 조정 | 밝기 | 대비)를 사용하고 7.3.4단계에 설명된 대로 이미지 스택을 RGB 형식으로 다시 변환합니다.
   위치
   8. 3D 투영을 로 저장합니다. TIF 파일(이미지 파일 형식) 및 .AVI 파일(비디오 파일 형식).

결과

재료