Using Spectral Reflectometry to Determine Myelinated Axon Diameters in a Fixed Mouse Brain Slice

초록

출처: Kwon, J., et al., Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ. J. Vis. Exp. (2018)

이 비디오는 초분광 컨포칼 현미경과 함께 분광 반사 측정을 사용하여 간섭 패턴을 분석하고 고정된 뇌 조직 절편에서 수초화된 축삭 직경을 결정하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다. 위원회.

1. 보정

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레이저 소스의 열 안정화를 허용하기 위해 이미징 최소 1시간 전에 현미경을 켜십시오(재료 표 참조). 그런 다음 스펙트럼 스캔을 위한 소프트웨어를 켜고(재료 표 참조) GUI(그래픽 사용자 인터페이스) 상단의 Acquire 버튼을 클릭합니다(그림 1a).

백색광 레이저(WLL) 및 광전자 증배관(PMT)의 소프트웨어 셔터를 켭니다(그림 1a).

획득 모드의 드롭다운 목록에서 xyΛ 모드를 선택하면 레이저 입력 모드가 자동으로 일정 백분율에서 일정 전력으로 변경됩니다. 자동 SP 이동의 체크 표시를 해제합니다. 그런 다음 Λ-Excitation Lambda Scan Settings에서 입력 레이저의 스펙트럼 창을 470–670nm로 설정하고 스펙트럼 단계 크기를 4nm로 설정합니다(그림 1b).

스펙트럼 범위에 대한 조정 막대를 두 번 클릭하거나 이동하여 PMT의 스펙트럼 범위를 450-690nm로 설정합니다(그림 1c).
참고: 이 스펙트럼 범위에는 입력 소스의 전체 대역폭이 포함되어야 합니다.

높은 개구수(NA > 0.7)를 가진 수침 대물 렌즈를 선택하고 PMT 및 레이저 출력에 값을 부여하여 AOBS를 활성화합니다(Acousto-optic beam splitter) 구성 및 라이브 스캔 버튼. AOBS 구성(Figure 1d).

현미경 스테이지에 참조 미러(재료 표 참조)를 장착합니다. 거울 표면은 대물 렌즈를 향해야 합니다. 현미경 스테이지에 거울을 장착하는 것이 쉽지 않은 경우 거울을 평판(e., slide 유리).

현미경 스테이지를 제어하여 초점면을 거울 표면에 정렬합니다.

검출기의 다이내믹 레인지를 고려하여 PMT 게인과 레이저 출력을 조정한 다음 레이저 입력 모드를 일정 백분율에서 일정 전력으로 변경합니다.
참고: 일반적으로 570nm에서 500(V)의 PMT 이득과 0.1%의 상대 레이저 출력이 사용됩니다.

의사 색상 모드에서 확인하여 파장 범위 전체에 채도가 없는지 확인합니다. 포화가 관찰되면 레이저 출력을 낮추십시오(그림 1a).

Lambda Scan 획득을 실행합니다.

어두운 참조를 얻기 위해 스테이지에서 미러를 제거하고 샘플 없이 동일한 획득을 반복합니다(i.e., 어두운 오프셋).

데이터를 다중 스택 TIF 형식으로 저장합니다.

2. SpeRe (Spectral reflectometry) 이미지 획득

1. 장착된 조직을 현미경 스테이지에 놓습니다. 조직을 대물 렌즈의 초점면에 대략적으로 정렬하려면 접안렌즈를 통한 광시야 형광 모드를 사용하십시오.
2. <span 사용 style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Live Scan 현미경 스테이지를 제어하여 초점면을 조직의 관심 영역에 정렬합니다. 커버슬립의 배경 소음을 방지하려면 유리-조직 계면에서 최소 15μm 깊이의 대상 영역을 선택하십시오.
3. 1.1–1.10단계에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 대상 영역에 대한 스펙트럼 이미지 스택을 획득합니다.
4. 조직 및 어두운 오프셋에 대한 데이터를 Multistacked TIF 형식.
   참고: 실험자는 이 단계에서 일시 중지할 수 있습니다.

3. 이미지 처리 및 분석

1. ImageJ에서 참조 미러와 뇌 조직에 대한 스펙트럼 데이터(다중 스택 TIF)를 엽니다.
2. 열린 이미지 스택에 대한 ROI(관심 영역)를 선택합니다. 즉, 참조 미러의 중앙 영역과 뇌 조직의 축삭 섬유 세그먼트를 선택합니다.
3. Image → Stacks → Plot Z-axis profile ImageJ 메뉴에서.
4. 다크 오프셋 데이터를 열고, 하나는 참조 미러로, 다른 하나는 뇌 조직으로 가져옵니다.
5. Image → Stacks → Plot Z-axis profile ImageJ 메뉴에서.
6. Copy and Paste 옵션을 사용하여 획득한 모든 스펙트럼을 저장합니다.
   참고: SpeRe 이미징의 경우, off-axis optical aberrations를 최소화하기 위해 central imaging field를 사용하는 것이 좋습니다. 축삭 섬유는 길이를 따라 구조적으로 이질적일 수 있습니다. 따라서 일반적으로 5μm< 작은 축삭 분절에서 ROI를 선택하여 부분 부피 아티팩트를 최소화하는 것이 좋습니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Apochromat objective 40×, NA 1.1	Leica Microsystems	15506357	물 침수 유형.
플루오로 미엘린 그린	F34651
Leica SP8 TCS microscope	Leica Microsystems	SP8
이미징 소프트웨어	Leica Microsystems	LAS-X
Matlab	MathWorks
Mirror	Thorlabs	PF10-03-P01	보호된 은색으로 코팅되었습니다.
커버 슬립	3306	Thickness: #1 (0.13 to 0.17 mm).
슬라이드 유리	5116-20F	Thickness: ~1mm.
슈퍼 접착제	록타이트 406	피부나 눈의 접촉을 피하기 위해 분배 장비를 사용하십시오.
white-light laser	NKT photonics	EXB-6	EXB-6은 중단되고 EXU-6으로 대체되었습니다.

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