광시트 형광 현미경을 사용한 운동 뉴런 투영 및 축삭 분지 시각화

Abstract

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57546/visualization-of-motor-axon-navigation-and-quantification-of-axon-arborization-in-mouse-embryos-using-light-sheet-fluorescence-microscopy'>Liau, E. S. et al. Visualization of Motor Axon Navigation and Quantification of Axon Arborization In Mouse Embryos Using Light Sheet Fluorescence Microscopy. J. Vis. 특급. (2018).

이 비디오는 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여 운동 뉴런 투영과 축삭 분기를 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 형질전환 마우스 배아. 운동 뉴런 성장 및 연결성을 평가하기 위한 샘플 준비, 이미징 및 축삭 분지의 3D 재구성과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

Protocol

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리에 의해 검토되고 승인되었습니다. 검토 위원회.

1. 광시트 형광 현미경 (LSFM) (2-3 h)

1. sample set-up
   1. 5X/0.1 조명 광학 장치 및 5X/0.16 감지 광학 장치를 설정합니다. 샘플 홀더와 샘플 모세관(1.5mm 내경, 녹색)을 조립하고 현미경에 넣습니다.
      참고: 자세한 설정 절차는 현미경의 사용 설명서를 참조하십시오.
   2. 다음과 같이 배아를 마운트하십시오 :
      1. P200 피펫 팁은 모세관의 직경에 맞도록 윗부분을 잘라내고 샘플 부착을 위해 뾰족한 부분(~ 3mm)을 제거하여 준비합니다.
      2. 작은 불꽃을 사용하여 피펫 팁의 뭉툭한 끝을 녹입니다.
      3. 불을 끄고 용융된 말단에 배아를 수직으로 빠르게 부착합니다.
      4. 피펫 팁의 윗부분을 샘플 모세관에 맞춥니다.
   3. 챔버 버퍼가 1분 동안 배아와 평형을 이루어 파편이나 기포를 제거하도록 합니다.
   4. 이미징 소프트웨어를 사용하여 Locate capillary locate 탭을 클릭하고 x, y, z 축을 조정하여 샘플 모세관을 배치합니다.
   5. 선택 Locate sample하고 0.6X로 확대하여 배아에 초점을 맞춥니다. 이미지화된 팔다리의 장축이 두 광원의 광 경로와 정렬되도록 배아를 회전합니다(그림 1B).
2. 이미지 획득 < 스타일 = 'margin-bottom : 0; margin-top : 0; padding-inline-start : 48px; '>
3. Under the 획득 tab, 감지 목표, 레이저 차단 필터, 빔 스플리터, 카메라 및 레이저와 같은 광 경로 매개변수를 정의합니다.
   참고: 본 실험에서는 녹색형광단백질(GFP) 채널을 사용하였다(여기파장: 488 nm, 방출 필터: 대역통과(BP) 505 내지 545 nm, 빔 스플리터: SPS LP 560).
4. 그림자 감소에 대한 피벗 스캔 확인란을 선택합니다.
5. 획득 설정 정의: 비트 심도, 16비트; 줌, 0.36-0.7X; 단면 조명(왼쪽/오른쪽) 또는 양면 조명.
6. 클릭 Continuous 레이저 강도, 노출 시간, 레이저 출력 및 광시트 위치를 설정하여 더 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다.
   참고: 레이저 출력은 광손상을 최소화하기 위해 가능한 한 낮게 유지됩니다.
7. 누르기 STOP 이미지 획득을 종료합니다.

다차원 획득

1. 첫 번째 이미지와 마지막 이미지의 Z 위치를 이동하여 z-스택을 정의합니다. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Optimal 슬라이스 번호를 설정합니다.
2. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Start Experiment 선택한 z-stack을 획득합니다.
3. 완료되면 이미지를 .czi 형식으로 저장하십시오.

이미지 처리 (선택 사항)

1. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>양면 융합<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Lightsheet Processing 채널. 멀티뷰 처리은 여러 각도에서 이미지를 결합하기 위해 다중 보기를 획득하는 경우 필요합니다.
2. Maximum Intensity Projection 채널.
3. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'Copy 채널에서 클릭 Subset 원본 세트에서 이미지의 하위 집합을 선택합니다.

2. 축삭 수목화의 정량화 (각 신경에 대해 30 분)

1. 이미징 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다(기본적으로 XYZ 데이터가 포함된 이미지는 Surpass 모드에서 3D 렌더링 보기로 열립니다).
2. Display Adjustmentwindow (편집 | Show Display Adjustment)을 사용하여 로컬 강도 대비를 기반으로 필라멘트를 감지합니다.
3. Add New Filaments아이콘을 선택하고 Autopath (no loop) 알고리즘을 드롭다운 메뉴에 있습니다.
4. 관심 영역(이 경우 관심 있는 분할 축삭)을 선택합니다. 클릭 다음 완료되면.
5. Slice 모드.
6. 관심 영역의 가장자리에 시작점을 지정합니다. 시작점을 수동으로 추가하거나 제거하려면 먼저 포인터 모드(navigate | Select) 그리고 <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Shift + 마우스 오른쪽 버튼 클릭 관심 지점에서.
7. 시드 포인트에 대한 수동 임계값을 선택하여 보이는 모든 수목화가 표시되도록 합니다. 포인터 모드 변경 (navigate | Select) 그리고 <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Shift + 왼쪽 클릭 관심 지점에서 시드 포인트를 수동으로 추가하거나 제거합니다.
   참고: 주변 신경의 배경 소음과 신호를 수동으로 제거하는 것이 중요합니다.
8. 확인란을 선택하십시오 시작점 주위의 시드 포인트 제거.
9. 확인 연결이 끊긴 세그먼트 제거 너무 멀리 떨어져 있고 배경 소음을 나타낼 수 있는 점을 제외할 수 있습니다. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'최대 간격 길이 다음 단계에서 제외.
10. 가우스 필터를 사용하여 모든 복셀의 배경 강도를 추정하는 배경 빼기에 대한 임계값을 조정합니다.
11. Approximate cross-section area를 사용하여 수상돌기 직경에 대한 자동 임계값을 설정합니다. 알고리즘.
12. 척추 계산 단계를 건너뜁니다.
13. 프로세스를 완료하고 원하는 스타일과 색상을 선택합니다.
14. Properties 재구성된 축삭돌기만 볼 수 있습니다.
15. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Statistics 탭, 선택 detailed. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>filament no를 사용합니다. 수상돌기 터미널 포인트 운동 신경 터미널을 운동 축삭 arborization의 지표로 정량화합니다.
    참고: 통계 원하는 경우 주석을 추가할 수 있습니다.
16. 재구성된 축삭돌기의 이미지를 .tif 파일로 내보냅니다.

Results

Materials