편평한 뇌 절편에서 피질 모듈의 조직화학적 이미징

초록

출처 : Lauer, S. M., et al. Visualization of cortical modules in flattened mammalian cortices. J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 조직화학적 염색을 사용하여 편평한 뇌 단면에서 피질 모듈을 시각화하는 방법을 보여줍니다. 사전 고정된 절편은 활성 신경 클러스터를 강조하는 변형 시약으로 처리되어 어둡고 대비가 높은 영역을 형성합니다. 장착 및 탈수 후, 피질 모듈은 명시야 현미경 아래에서 어둡고 고르지 못한 패턴으로 나타납니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 사이토크롬 산화효소 염색을 사용한 피질 모듈의 시각화

참고: 사이토크롬 산화효소 활성의 조직화학적 검출을 위해 다양한 염색 프로토콜이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 니켈-황산암모늄(NiAS)을 사용하여 염색된 피질 영역에서 더 높은 대비와 더 나은 정의된 모듈을 생성합니다.

1. 사이토크롬 산화효소 염색 용액을 준비합니다. 용액 10mL에 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충액 10mL(0.1M, pH 7.4), 수크로스 400mg, NiAS 12.5mg, 시토크롬 C 2mg 및 디아미노벤지딘(DAB) 6mg을 추가합니다.
   주의: DAB와 NiAS는 발암성입니다.
   참고: 섹션 인큐베이션 직전에 DAB를 추가합니다.
2. 셰이커에서 HEPES 완충액(0.1M, pH 7.4)의 단면을 15분 동안 세척합니다.
3. 염색 용액의 단면을 셰이커에서 실온으로 배양합니다. 위치
   참고: 염색 속도를 관찰하십시오. 눈에 띄는 반응이 없으면 37 ° C에서 배양으로 변경하십시오.고정량에 따라 10 분 후 또는 몇 시간 후에 염색이 관찰 될 수 있습니다.
4. 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 반응을 중지합니다. 이것은 원치 않는 재염색과 배경 신호의 증가를 방지합니다.
5. HEPES 버퍼를 사용하여 10분 동안 섹션을 세 번 세척합니다.
6. 유리 슬라이드에 섹션을 장착하고 건조시킵니다.
7. 알코올 농도가 증가하여 섹션을 탈수합니다.
   1. 슬라이드를 60% 에탄올로 1분 동안 세척합니다. 슬라이드를 80% 에탄올로 1분 동안 세척합니다. 슬라이드를 96% 에탄올로 2분 동안 세척합니다. 슬라이드를 100% 에탄올로 3분 동안 세척합니다. 슬라이드를 이소프로판올로 5분 동안 세척합니다. 슬라이드를 자일렌으로 5분 동안 세척합니다.
8. 즉시 빠른 경화 장착 매체를 추가하고 커버슬립을 추가합니다. 비판: NiAS가 씻겨 나와 염색을 저하시키므로 수성 장착 매체를 사용하지 마십시오.
9. 장기 보관을 위해 섹션을 4°C로 유지하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
cytochrome oxidase staining
cytochrome c from equine heart	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	Carl Roth	9105.4
마운팅 또는 냉동 매체
Eukitt (조직 화학)	Sigma-Aldrich	3989
알코올 탈수
에탄올 100 %	Carl Roth	9065.3
에탄올 96 %	Carl Roth	P075.3
2- 프로판올	Carl Roth	6752.4
크실렌 대체품	Fluka	78475
장치/도구
Dumont 55 집게 - Inox	Fine Science Tools	11255-20
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