동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 좌골 신경과 DRG의 소화
- 100μg/mL의 데옥시리보뉴클레아제가 보충된 소화 매체(Dulbecco's Modified Eagle Medium[DMEM], 10mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid [HEPES], 5mg/mL 소 혈청 알부민[BSA], 1.6mg/mL 콜라겐분해효소 Type 4)을 준비하고 얼음에 보관합니다.
참고: 마우스(좌골 신경 + DRG) 당 필요한 소화 매체의 양은 1mL입니다. 일단 준비되면 분해 매체의 부분 표본은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. - 한 마우스의 좌골 신경과 DRG를 500μL의 소화 매체가 들어 있는 별도의 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 좌골 신경의 경우 스프링 가위를 사용하여 재료를 15-20 조각으로 자른 다음 37 ° C의 진탕 인큐베이터에서 부드러운 교반 (≤ 450 rpm)으로 20 분 동안 조직 현탁액
을 배양합니다.- 1,000μL 피펫 팁을 통해 세포 현탁액을 반복적으로 분쇄하여 불완전하게 분해된 조직을 기계적으로 분리합니다.
참고: 현탁액을 적정하기 어려운 경우 피펫 끝을 가위로 잘라 끝이 뭉툭하게 만듭니다. 37°C에서 부드러운 교반(≤ 450rpm)으로 20분 동안 조직 현탁액을 배양합니다. - 1,000 μL 피펫 팁을 통해 분쇄를 반복하고 37 °C에서 부드러운 교반(≤ 450 rpm)으로 10분 더 배양합니다.
- FACS 완충액(10% 태아 송아지 혈청[FCS] 및 1mM 에틸렌디아민 테트라아세트산[EDTA]이 보충된 인산염 완충 식염수[PBS])을 준비하고 얼음에 보관합니다. 얼음 위의 60 x 15mm 페트리 접시에 형광 활성화 세포 분류(FACS) 버퍼가 있는 140μm 메쉬 크기의 스테인리스 스틸 스크린을 헹구고 담급니다.
참고: 나일론 스크린 필터는 핵이 형성된 세포의 수율에 상당한 손실을 초래하므로 피해야 합니다. - 뭉툭한 집게로 얼음 위에 페트리 접시 위에 올려 놓은 것처럼 140μm 스크린 필터를 통해 조직 현탁액을 반복적으로 통과시킵니다. 페트리 접시에서 세포 현탁액을 수집하여 얼음에 보관된 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 필터에 남아 있는 불완전하게 소화된 조직을 1,000μL 피펫 팁으로 반복적인 분쇄를 통해 밀어 넣습니다. 500μL의 FACS 버퍼로 스크린 필터를 두 번 헹구고 생성된 세포 현탁액을 페트리 접시에 수집하여 1.6단계의 세포 현탁액과 결합합니다.
참고: 사용된 유세포 분석기가 파편에 민감한 경우 1.7단계의 세포 현탁액을 70μm 스크린 필터를 통과할 수 있습니다. 그러나 이는 핵이 있는 세포의 수율 손실로 이어질 수 있습니다. - 세포 현탁액을 300 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.상등액을 버리고 세포 펠렛을 1mL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 이 세탁 단계를 한 번 반복합니다.
- 필요한 염색 횟수에 따라 150-350μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다(염색 패널당 150μL FACS 완충액).
2. 유세포 분석을 위한 형광 표지 항체를 사용한 좌골 신경 및 DRG의 염색
- 좌골 신경 또는 DRG 세포 현탁액의 100μL를 얼음 위의 96웰 플레이트에서 V자형 웰로 전달합니다.
참고: Single-stained cell은 PMT(Photomultiplier Tube) 전압 이득 및 보상과 관련하여 유세포 분석을 설정하는 데 필요한 제어를 제공하고 특이적 결합과 비특이적 결합을 구별하는 데 도움이 되기 때문에 사용되는 모든 항체에 필요합니다. - 좌골 신경 또는 DRG 샘플에서 나머지 세포 현탁액(샘플당 약 50μL)을 풀링하여 염색되지 않은 대조군 역할을 합니다.
- 400 x g의 플레이트를 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 접시를 쓰레기통 위에 뒤집어 놓고 손목을 세게 튕겨 상층액을 버리고 종이 타월로 부드럽게 두드려 말립니다.
- 표면 염색의 경우, 관심 항체(CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5 및 주요 조직적합성 복합체[MHC] Class II-Biotin)를 포함하는 20μL의 FACS 완충액에 각 세포 펠릿을 재현탁하고 빛으로부터 보호되는 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
참고: (1) 최적의 항체 희석은 사용 전에 제조업체의 제품 정보에 따라 희석 시리즈를 수행하여 결정해야 합니다. (2) 비특이적 염색은 제조업체의 지침에 따라 이 단계에서 Fc-block으로 배양하여 줄일 수 있습니다. (3) 동형광단과 직접 접합된 1차 항체를 사용하거나 관심 항원이 별개의 집단을 생성하는 경우 일반적으로 동형(isotype) 대조군 염색이 필요하지 않습니다. - 각 웰에 130μL의 FACS 완충액을 추가하고 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다.앞서 설명한 대로 상등액을 버리고(단계 2.3) 150μL의 FACS 완충액으로 세포 펠릿을 두 번 세척합니다.
참고: 비접합 1차 항체 또는 비오틴에 접합된 1차 항체를 사용하는 경우, 이 시점에서 형광단에 접합된 적절한 2차 시약을 첨가할 수 있으며 2.4-2.5단계를 반복합니다. 이 프로토콜의 경우, streptavidin-PE/Cy7 또는 Streptavidin-PerCP를 사용하여 CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5와 함께 또는 CD68-APC 및 F4/80-PE/Cy7과 각각 MHC Class II를 검출했습니다. - 고정을 위해 마지막 세척 단계 후 PBS(pH 7.4)의 4% 파라포름알데히드 100μL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 플레이트를 얼음 위에서 10분 동안 배양한 다음 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.앞서 설명한 대로 상등액을 버리고(2.3단계) 150μL의 FACS 완충액으로 세포 펠릿을 한 번 세척합니다.
주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 장갑과 안경과 같은 적절한 보호 장비를 착용하고, 등.
참고: 세포 펠릿을 150μL의 FACS 완충액에 재현탁하고 빛으로부터 보호된 상태로 4°C에서 최대 2일 동안 보관합니다. 세포 내 염색이 필요하지 않은 경우 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리한 후 2.11단계로 진행합니다. - 세포 내 염색의 경우, 세포 펠릿을 150μL의 FACS 완충액+0.5% 세제에 재현탁하고 15분 동안 빛으로부터 보호된 실온에서 배양합니다. 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리합니다. 앞서 설명한 대로 상층액을 버리고(단계 2.3) 150μL의 FACS 완충액+0.5% 세제로 셀 펠릿을 한 번 세척합니다. 관심 항체(CD68-APC, CD206-PE)가 포함된 20μL의 FACS buffer+0.5% 세제에 세포 펠렛을 재현탁하고 빛으로부터 보호된 상태로 실온에서 30분 동안 배양합니다.
- 각 웰에 130μL의 FACS 완충액+0.5% 세제를 추가하고 400°C에서 5분 동안 400 x g에서 플레이트를 원심분리합니다. 앞서 설명한 대로 상등액을 버리고(단계 2.3) 150μL의 FACS 완충액+0.5% 세제로 셀 펠릿을 두 번 세척합니다.
참고: 비오틴에 접합된 1차 항체 또는 비오틴에 접합된 1차 항체를 사용하는 경우, 이 시점에서 형광단에 접합된 적절한 2차 시약을 추가하고 2.9-2.10단계를 반복할 수 있습니다. - 세포 펠릿을 150μL의 FACS 완충액+0.5% 세제에 재현탁하고 빛으로부터 보호하여 4°C에서 최대 2일 동안 보관합니다.
- 5 μg/mL4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이 보충된 150 μL FACS buffer+0.5 % detergent로 세포 펠릿을 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 실온에서 5분 동안 배양합니다. 400 x g에서 4°C에서 5분 동안 플레이트를 원심분리하고, 앞서 설명한 대로 상등액을 폐기합니다(2.3단계).
- 세포 펠릿을 150μL의 PBS에 재현탁시키고 적절하게 라벨링된 FAC 튜브로 옮깁니다. 분석 준비가 될 때까지 빛으로부터 보호되는 실온에 보관하십시오.
참고: PBS에서 재현탁 후 DAPI가 DNA에서 천천히 해리되어 신호 손실로 이어지기 때문에 몇 시간 내에 세포를 분석해야 합니다.
3. 유세포 분석 설정 및 샘플 실행
- 유세포 분석기에 세포를 염색하는 데 사용되는 형광단을 측정하기 위한 적절한 레이저 및/또는 필터 세트가 장착되어 있는지 확인하십시오. 이는 시스템의 기본 세포 분석기 구성에서 확인할 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 3개의 레이저(405nm, 488nm 및 633nm)가 장착된 유세포 분석기를 사용하여 세포를 분석하여 ≤ 5개의 형광단을 검출할 수 있었습니다.
- 관심 형광단을 검출하기 위한 적절한 채널을 선택합니다. 모든 형광 신호는 로그 증폭으로 가장 잘 감지됩니다.
- 샘플에 적합한 유속을 선택합니다. 이 매개변수는 사용하는 시스템에 따라 달라질 수 있으며 경험적으로 결정해야 합니다. 이 프로토콜의 경우 바늘의 막힘을 방지하기 위해 MED-to-HI(35-60μL/min)의 유속이 사용되었습니다.
- 샘플당 수집할 총 이벤트/셀 수를 선택합니다. 최소 이벤트 수는 1,000,000개여야 합니다.
- 측면 산란 영역(SSC-A) 대 전방 산란 영역(FSC-A)의 글로벌 워크시트 아래에 산점도를 생성하고, 관심 형광단과 FCS-A에 대한 각 형광단에 대해서도 산점도를 생성합니다. 선택한 형광단에 대한 이벤트 수와 평균 형광 강도(MFI)를 표시하는 통계 보기를 만듭니다.
- 볼륨을 설정합니다.tag가장 작은 셀이 산점도의 왼쪽 하단 10%에 맞도록 FSC-A 및 SSC-A 채널의 e. 좌골 신경 또는 DRG의 염색되지 않은 대조군에서 배경 형광과 최소 샘플 형광을 측정합니다.DAPI 전용 염색 대조군의 산점도를 기반으로 부모(P1) 게이트를 결정합니다.
참고: 이것은 말초신경계(PNS)에서 DAPI+ 개체군의 이질적인 특성으로 인해 수집 게이트가 아닙니다. - 관심 형광단 각각에 대한 FSC 산점도를 사용하여 염색되지 않은 대조군의 세포가 해당 산점도의 하위 분기 내에 속하도록 전압을 조정합니다. 그런 다음 이 영역 위에 게이트를 생성하여 각 마커/형광단에 대해 양성인 세포를 정의합니다. 게이트의 배치는 단일 염색 대조군을 실행하여 확인합니다(2.1단계).
참고: 중첩 방출 스펙트럼에 대한 보상은 이 시점에서 수행하거나 적절한 분석 소프트웨어를 사용하여 소급하여 적용할 수 있습니다. - 유세포 분석기가 설정되면 설명된 대로 샘플을 실행할 수 있습니다.
- 실행 후 나머지 샘플 재료를 폐기하고 추가 분석을 위해 FCS 파일을 내보낼 수 있습니다.
