광간섭 단층촬영(Optical Coherence Tomography)을 사용한 마우스 망막의 In vivo 이미징

초록

출처: Jagodzinska, J., et. al., Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo. J. Vis. 특급. (2017) <br />

이 비디오에서는 SD-OCT(spectral-domain optical coherence tomography)를 사용하여 망막층을 이미지화하고 시신경병증이 있는 유전자 변형 마우스 모델의 구조적 변화를 평가하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마우스 준비

1. 눈 확장 및 고정
   1. 데이터 수집 최소 15분 전에 10% 페닐에프린 점안액을 마우스 눈에 주입하고 초과분을 제거하며 0.5% 트로피카미드 점안액을 주입합니다.
      참고: 첫 번째 확장은 세션에서 테스트 할 모든 마우스에 대해 한 번에 수행 할 수 있습니다. 액체가 실온에 있는지 확인하십시오.
   2. 전신 마취를 유도한 직후(1.2단계), 0.4% 옥시부프로카인 염산염 점안액을 투여하고 3초 동안 제자리에 유지하여 눈을 마취하고 고정시킵니다. 그 후, 방울을 닦아내고 10% 페닐에프린과 0.5% 트로피카마이드를 반복적으로 주입하여 눈이 잘 확장되었는지 확인합니다.
      참고: 액체가 실온에 있고 마우스가 옥시부프로카인을 삼키지 않는지 확인하십시오.
2. 전신 마취
   1. 식염수에 케타민(20mg/mL)과 자일라진(1.17mg/mL)의 마취 용액을 준비합니다. 4 °C에서 최대 2 주 동안 보관하십시오.
   2. 테스트 약 5분 전에 마우스의 연령과 크기에 따라 체중 1g당 5 - 10μL의 마취 용액을 복강내 주사합니다.
      참고: 어리거나 마른 쥐는 마취제가 덜 필요하고 마취 시간이 덜 걸리지만 더 빨리 깨어납니다. 여기서, 8 μL/g(케타민 160 mg/kg, 자일라진 9.33 mg/kg)입니다.
   3. 선택적으로, 각막 건조를 방지하기 위해 점성이 있는 점안액이나 안과 젤로 눈을 윤활하십시오.

2. 마우스 위치

1. 점성이 있는 글리콜 성분의 안약으로 눈을 윤활하여 각막에 수분을 공급합니다.
   NOTE: 눈이 건조해 보일 경우 검사 중에 안약을 다시 바르십시오.
2. 수술용 거즈로 마우스를 감싸 따뜻하게 유지합니다.
3. 스펀지나 면심지를 사용하여 0.3% 하이프로멜로스가 함유된 안과용 젤을 각 눈에 얇게 펴 바르면 빛의 굴절을 최소화하고 혼탁을 피하며 각막에 수분을 공급할 수 있습니다. 이때 속눈썹과 수염을 옆으로 치우십시오.
4. 머리를 곧게 펴고 앞을 향하게 하여 마우스를 카세트에 놓습니다.
5. 바이트 바 클램프를 부드럽게 열고 바를 입에 넣습니다. 노즈 밴드를 사용하여 위치를 고정합니다.
   참고: 확인하십시오. 바이트 바는 카세트 중앙에 있습니다.
6. 오른쪽(왼쪽) 눈을 테스트하는 경우 오른쪽(왼쪽) 아래에 면봉을 놓습니다.
7. 클립온 조준 팁을 마우스 전용 렌즈에 고정한 상태에서 Z-트랜슬레이터 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 눈 쪽으로 가져옵니다.
8. 카세트를 회전 및 회전하고 바이트 바와 X-트랜슬레이터 나사를 돌려 마우스의 위치를 미리 설정합니다. 목표는 오른쪽 눈이 렌즈를 직접 들여다보도록 하여 눈과 수정체의 광축을 정렬하는 것입니다.
   참고: 마우스가 너무 높거나 낮으면 Y 변환기 나사를 먼저 사용해야 합니다.
9. "Exam"에서 첫 번째 스캔을 선택하고 "Start Aiming"을 클릭한 다음 망막 이미징에 대한 추가 수동 조정을 수행합니다.
   1. Z-translator 나사를 사용하여 왼쪽 패널에서 망막을 수직으로 이동합니다(그림 1, Horizontal B-scan Alignment) 및 오른쪽 패널에서 가로로(그림 1, 세로 B-스캔 정렬).
   2. ONH를 위 또는 아래로 움직여 카세트를 회전하여 ONH를 오른쪽 패널 중앙으로 가져옵니다. 바이트 바 나사를 사용하여 오른쪽 패널의 망막을 곧게 펴십시오. 카세트를 돌려 ONH를 왼쪽 패널 중앙에 배치합니다.
   3. X-트랜슬레이터 나사를 사용하여 왼쪽 패널의 망막을 수평으로 맞춥니다. 각 변조기의 주요 기능을 염두에 두고 망막의 위치를 추가로 조정하여 ONH를 중앙 집중화합니다.
      참고: 필요한 경우 Y-트랜슬러 나사를 사용하여 오른쪽 패널에서 ONH를 위아래로 움직입니다. 위치는 스캔 사이에 언제든지 조정될 수 있습니다.

3. ONH 및 Retina의 SD-OCT 이미징

1. 조정 내용이 완료되면 "스냅샷 시작"을 클릭하여 SD-OCT 스캔을 시작합니다.
   1. 3D 이미징이 필요하지 않은 경우 OCU 옵션을 선택 취소하십시오.
2. 스캔과 보고서를 저장합니다.
3. 다음 스캔을 진행합니다.
4. 렌즈를 집어넣은 후 두 번째 눈을 이미지화하려면 카세트를 적절하게 돌리고 2.6-3.3단계를 반복합니다.

4. 획득 완료

1. 획득이 완료되면 카세트에서 마우스를 제거하고 각 눈에 0.3% 하이프로멜로스가 함유된 점과 젤을 바르고 마우스를 가열판에 올려 놓고 깨어납니다.
2. 마지막 취득 후 소프트웨어를 닫고 컴퓨터와 OCT 기기(전원 버튼)의 전원을 끕니다.
3. 소독제로 카세트를 청소하십시오.

5. analysis

1. 망막층 두께를 측정하려면 제조업체에서 제공하는 자동 분할 소프트웨어를 사용하십시오.
   1. "Patient"를 클릭하고 목록에서 원하는 "Exam"을 선택한 다음 "Review Exam" 옵션을 클릭합니다.
   2. 원하는 스캔에서 폴더 아이콘을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 원하는 OCT 데이터를 OCT 소프트웨어에 로드합니다.
   3. B-스캔을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 최대 10개의 측정 캘리퍼를 활성화하여 캘리퍼를 구성합니다. 을 클릭하고 이름, 각도 및 색상을 입력합니다.
   4. B-스캔을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 원하는 캘리퍼를 선택합니다. 측정을 위해 그에 따라 망막에 놓습니다.
      참고: ONH를 중심으로 한 스캔의 경우 서로 같은 거리에 있는 각 측면에 5개의 캘리퍼를 설정합니다. 유두주위 분석을 위해 캘리퍼가 ONH에서 너무 멀리 배치되지 않았는지 확인하십시오. 방사형 스캔의 경우 OCT 소프트웨어에서 선택한 스캔당 10개의 사진을 분석합니다. 그들의 번호는 "보고서" 폴더에서 찾을 수 있습니다.
   5. B-스캔을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "결과 저장"을 클릭하여 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 분석을 위해 결과를 저장합니다.
      참고: 결과는 스캔 데이터와 동일한 폴더에서 찾을 수 있습니다.
2. 또는 오픈 소스 이미지 처리 프로그램용으로 개발된 수제 캘리퍼 매크로인 "MRI Retina Tool"을 사용합니다(재료 표 참조).
   1. MRI Retina Tool" 및 "Modify Polygon Section Tool" 매크로가 활성화되어 있는지 확인하십시오. 이미지를 로드합니다. m 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다.
      참고: 매크로는 ONH의 양쪽에 0.2mm 길이의 측정 카세트 1개를 자동으로 생성합니다. 각 카세트에는 캘리퍼 역할을 하는 5개의 측정 지점이 있습니다. 측면 위치는 변경할 수 없으며 방사형 스캔의 peripapilla에 맞게 맞춤화됩니다. 카세트의 수평 위치는 RNFL/GCL 두께를 측정하기 위해 미리 정의되어 있지만 대신 GC 복합층을 측정하도록 쉽게 수정할 수 있습니다. 스캔 품질이 좋지 않으면 수평 위치를 조정하거나 사진을 분석에서 제외해야 합니다.
   2. 수평 조정은 e 버튼을 클릭하십시오. 새로 열린 "ROI Manager" 창에서 첫 번째 카세트를 선택합니다.
   3. 파란색 다각형 버튼을 클릭하고 그림에서 측정된 레이어의 테두리를 클릭하여 첫 번째 카세트의 위치를 조정합니다.
   4. 먼저 "ROI Manager" 창에서 두 번째 카세트를 선택한 다음 해당 이미지를 클릭하여 두 번째 카세트에 대해 반복합니다. r 버튼을 클릭하여 다시 측정합니다. "측정" 창에서 결과를 봅니다.
      NOTE: 결과는 언제든지 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에 복사될 수 있습니다. 여기에는 오른쪽 카세트(r), 왼쪽 카세트(l) 및 총계에 대한 다음 값이 포함됩니다.Intden - 카세트 내 통합 밀도; 영역: 측정 영역(mm2)입니다. Len: 카세트 내의 캘리퍼 길이(mm); Mean: 카세트 내 신호의 평균 강도; 및 Std: 신호의 평균 강도의 표준 오차입니다.
   5. 다음 이미지로 진행합니다.
   6. 스프레드시트 소프트웨어 프로그램에서 데이터를 추가로 분석합니다.
      참고: 레이어의 평균 두께를 찾으려면 10개의 Len 값을 취하십시오.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Mice
Opa1delTTAG mouse	몽펠리에 신경과학 연구소, INSERM UMR 1051, 프랑스	-	C57Bl6/J 배경에 OPA1 c.2708_2711delTTAG 돌연변이를 운반하는 Opa1 넉인 마우스
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, 독일	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT 이미징 시스템 소프트웨어	Bioptigen, Leica Microsystems, 독일	-	OCT 수집 및 분석용 소프트웨어
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, 미국 국립보건원(National Institutes of Health)	-	분석용 소프트웨어는 두 개의 홈메이드 매크로를 다운로드하여 설치해야 합니다: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	저체온증으로부터 보호
Supplies
Gauze pads 3"x3"	Curad, 미국	CUR20434ERB	저체온증에 대한 보호
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, 미국	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, 프랑스	T.7979C.CS	마우스 위치
시약 및 약물
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, 모나코	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	국소 마취
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	전신 마취
Rompun	Bayer Healthcare, 독일/CentraVet, France	ROM001	전신 마취, 진통, 근육 이완
NaCl 0,9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, 미국	-	눈의 수분
GenTeal'	Alcon, Novartis, 미국	-	빛의 굴절과 불투명도를 최소화하는 안과 젤
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	소독제