transducted mouse embryonic brain slices에서 피질 뉴런 요골 이동의 타임랩스 이미징

초록

Source:<span style='background-color:#f9f9f9;color:#1155cc;'>Wiegreffe, C., et. al., 배아 마우스 뇌의 유기형 슬라이스 배양에서 이동하는 뉴런의 타임랩스 공초점 이미징 자궁에서 Electroporation. J. Vis. 특급. (2017)

이 비디오는 심실하 영역에서 피질 뉴런 방사상 이동을 관찰하기 위한 타임랩스 컨포칼 현미경을 보여줍니다. 형질도입된 마우스 배아 뇌 절편에서 방사형 신경교골(radial glial scaffolds)을 통해 피질 플레이트(cortical plate)로.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.

1. 타임랩스 이미징

1. 현미경 설정
   1. 도립 컨포칼 현미경의 무대에 배치된 기후 챔버를 37°C 및 5% 이산화탄소 대기로 설정합니다. 하이브리드 검출기를 사용하여 레이저 강도를 줄이고 세포 생존력을 향상시킬 수 있습니다. 자세한 분석을 위해 개구수가 0.6 이상인 매우 긴 작동 거리 40X 건식 대물렌즈를 사용하십시오.
      참고: 현미경의 모든 구성 요소는 이미징 과정에서 안정적인 초점을 제공하기 위해 이미징 전에 2-3시간 동안 37°C로 예열해야 합니다.
2. Slice Imaging
   1. 도립 형광 현미경을 사용하여 멤브레인 인서트가 포함된 6-well plate에서 이미징을 위한 뇌 슬라이스를 선택합니다.
      주의: 자외선에 장기간 노출되면 세포 광손상이 발생할 수 있으므로 피하십시오.
      위치 참고: 상부 SVZ(뇌실하 영역)의 밝은 단일 뉴런이 슬라이스의 pial 표면을 향해 방사상으로 이동하는 슬라이스를 선택합니다. 전체 CP(피질판)에 걸쳐 있는 방사상 신경교세포의 미세한 형광 과정은 방사상으로 이동하는 피질 뉴런에 의해 사용되는 온전한 방사형 신경교세포를 나타냅니다.
   2. 타임 랩스 이미징을 위해 선택된 슬라이스가 있는 멤브레인 인서트를 집게를 사용하여 2ml의 슬라이스 배양 배지가 들어 있는 50mm 직경의 유리 바닥 접시에 옮깁니다. 접시를 컨포칼 현미경의 기후 챔버에 놓습니다.
   3. 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하고 스캔 속도를 400Hz에서 700Hz로 높여 프레임 속도를 초당 약 1.4프레임에서 약 2.5프레임으로 각각 높입니다. 평균적으로 두 번 이상 사용하지 마십시오. 1.5μm의 스텝 크기로 전기천공 영역(보통 400-100μm)을 통해 z-스택을 정의합니다. 전체적으로 이러한 설정은 이미지의 충분한 해상도와 밝기를 허용하면서 획득하는 동안 광손상을 낮게 유지합니다. 30분마다 z-스택을 찍어 타임랩스 시리즈를 시작합니다.
      참고: 슬라이스가 레이저 광선에 장기간 노출되면 광손상이 유발되어 세포의 생존력이 감소합니다. 그에 따라 레이저 광에 대한 노출 시간을 조정합니다.
   4. ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/iij/) 또는 이와 동등한 소프트웨어를 사용하여 타임랩스 시리즈를 분석합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6-well plate	Corning	351146
inverted fluorescence tissue culture microscope	Leica	DM IL LED
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경	Leica	TCS SP5II
Hybrid detector	Leica	HyD
Objective, 40x/0.60 NA	Leica	11506201
현미경 온도 제어 시스템	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
Cell culture insert	Millipore	PICM0RG50
Microgrind	Narishige	EG-45	베벨링에 38° 각도 사용
피코스프리처 III
5mm 백금 디스크 전극이 있는 핀셋	Sonidel	CUY650P5
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
상자 필라멘트	Sutter Instrument	FB255B	2.5 mm x 2.5 mm
Micro-spoon spatula	VWR	231-0191	185mm x 5mm
유리 바닥 접시, 50mm	World Precision Instruments	FD5040-100

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