컨포칼 현미경을 사용한 제브라피시 유충의 선택적 단일 뉴런 레이저 절제

초록

출처: Morsch, M., et. al., Triggering cell stress and death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. J. Vis. 특급. (2017)

이 비디오에서는 형질전환 제브라피시의 개별 뉴런을 정확하게 표적화하고 연구하기 위한 고강도 UV 레이저 절제 기술을 살펴봅니다. 우리는 신경 반응을 준비하고, 고정하고, 시각화하는 방법을 보여주며, 부상과 회복의 세포 역학을 강조합니다.

프로토콜

1. 아가로스에 제브라피시 임베딩을 위한 솔루션을 준비합니다.
   1. 달걀 물이 담긴 페트리 접시에 4g/L MS222(트리카인 스톡 용액, pH 7.0)를 적가하여 마취 용액을 준비합니다. 50mg/L의 복용량을 권장하는 시작점입니다(Figure 1A).
   2. 달걀 물에 저융점 아가로스(0.8 - 1.5%)를 준비하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 분취합니다. 부분 표본을 예열된 가열 블록(38 - 40 °C)에 넣고 설정 온도(~ 30분; 그림 1B).
   3. 선택 사항: 장기 이미징(> 4시간)을 위해 35mm 유리 바닥 페트리 접시 안에 작은 아가로스 원을 준비하고 굳힙니다.
      참고: 이 추가 단계는 장기간에 걸쳐 제브라피시와 함께 전체 아가로스 방울의 움직임을 피하는 데 효과적이었습니다.
      1. 그렇게 하려면, 유리 바닥 접시의 안쪽 원을 따라 ~ 300 μL의 아가로스를 배치하여 중간에 작은 구멍이 있는 도넛 모양의 원을 준비합니다(단계 1.5.3).
2. 현미경 검사를 위해 제브라피쉬를 아가로스에 장착합니다.
   1. 절제를 위해 사전 선별된 물고기 중 1 - 3을 선택하고 마취액이 있는 접시에 옮겨(전사 피펫 사용)하여 유충을 마취시킵니다(단계 1.4.1; 그림 1C; 약 5분).
      참고: 물고기가 얕은 수술 움직임을 보이고 심장 박동수가 감소하고 더 이상 촉각을 유발하는 탈출 반응(TEER, 브러시로 꼬리를 부드럽게 만진 후 헤엄쳐 도망가지 못함)을 보이지 않을 때 마취됩니다. 물고기의 윤리적 치료를 위해 적절한 마취를 보장하고 아가로스로 옮기거나 형광등에 노출될 때 경련을 방지합니다.
   2. 마취가 확인된 후 조절 가능한 피펫(절단 200μL 팁은 ~ 30μL로 설정)을 사용하여 유충을 빨아들이고 팁 바닥으로 가라앉힙니다. 유충과 함께 액체 한 방울을 아가로스에 방출하여 유충을 예열된 아가로스로 옮깁니다(아가로스로 들어가는 계란 물의 양을 최소화하십시오. 그림 1D).
   3. 아가로스에 둘러싸인 물고기를 빨아먹는다. 미리 준비한 유리 바닥 35mm 접시에 빠르게 분배합니다.
   4. 해부 현미경과 표준 페인트 브러시(긴 라이너, 크기 1)를 사용하여 몸통과 꼬리가 평평하도록 아가로스 안의 동물을 측면(머리에서 왼쪽)에 배치합니다(그림 1E). 여러 마리의 물고기로 작업하는 경우 나중에 컨포칼 현미경을 사용하여 쉽게 찾을 수 있도록 접시에 있는 모든 물고기를 정렬합니다.
      참고: 이 위치 지정 및 정렬 절차를 신속하게 수행합니다(아가로스가 더 낮은 온도에 노출된 직후 굳기 시작하므로 약간의 연습이 필요할 수 있음).
   5. 아가로스가 단단히 굳을 때까지 아가로스가 박힌 물고기를 10-15분 동안 그대로 두십시오. 35mm 페트리 접시에 트리카인이 함유된 달걀수 ~ 2mL를 조심스럽게 채웁니다(Figure 1F)입니다.

2. 컨포칼 현미경 및 이미징 매개변수 설정

1. 유충이 내장된 페트리 접시를 컨포칼 현미경 스테이지에 놓고 동물 척수의 등쪽에 초점을 맞춥니다(명시야 사용). 적절한 배율(40X)과 형광 설정에서 동물을 검사하고 관심 구조를 시각화합니다(e., 라벨링된 뉴런 또는 미세아교세포 운동의 형광 강도)를 사용하여 모든 이미징 매개변수가 후속 절제에 필요한지 확인합니다(그림 2). 우리는 일상적으로 40X 대물렌즈를 사용하여 타임랩스 연구를 수행합니다.
2. 선택 사항: 몇 시간 동안 타임랩스 연구를 수행하려면 세포와 그 환경의 동요되지 않은 생리적 반응을 확립하기 위해 절제 전에 단일 또는 몇 개의 시점을 기록하는 것이 좋습니다(예: 기준선 속도와 운동성을 설정하기 위한 미세아교세포 이동).
3. UV 레이저 절제에 대한 관심 구조의 두께를 결정합니다.
   1. z-drive를 사용하여 관심 구조체의 상단과 하단을 확인합니다(예: the cell soma) 수동으로 위아래로 초점을 맞춥니다. 절제 할 z-plane을 기록해 둡니다 (e., 셀의 중심).
      참고: 경험에 비추어 볼 때, 이 방법은 밝게 라벨링된 척수 뉴런을 표적으로 삼는 것이 가장 효과적이었습니다(절제 후 타임랩스를 쉽게 시각화할 수 있는 높은 신호 대 잡음비; e.g., 그림 4) 그리고 세포체의 중앙을 절제함으로써. 세포핵 형광은 올바른 표적화와 높은 절제 효율을 보장하는 데 유리할 수 있습니다.

3. 제브라피쉬의 개별 세포에 대한 표적 레이저 절제 수행 척수

참고: 이 절제 및 시각화 접근 방식에는 컨포칼 현미경(Leica SP5)이 사용되었습니다. 세포 특이적 파괴를 위해 405nm 다이오드를 사용하는 절제 절차는 소프트웨어(Leica Application Suite, v2.7.3.9723)에 따라 자세히 설명되어 있습니다. 그러나 405nm 레이저와 FRAP(광표백 후 형광 회복) 또는 표백제 모듈이 장착된 기존의 컨포칼 현미경은 동일한 세포 조작 성능을 허용하지만 설정, 매개변수 및 이름이 약간 다를 수 있습니다.

1. 소프트웨어 메뉴 상단의 드롭다운 메뉴를 클릭하여 FRAP 마법사를 시작합니다(그림 3A, 1 and 2). 레이저 절제에 대한 특정 매개변수를 설정할 수 있는 다양한 단계가 있는 새 창을 관찰합니다(그림 3B, 3).
2. 형식, 스캔 속도를 선택하여 절제 접근 방식에 대한 이미지 매개변수를 결정합니다(그림 3B, 4), 및 평균(그림 3B, 5). 400Hz의 스캔 속도와 4의 라인 평균에서 1,024 x 1,024의 이미지 형식이 가장 적합했습니다.
   참고: 일반적으로 스펙트럼 감지(예: 여기 또는 방출 파라미터)를 변경할 필요가 없으며, 이는 이전 획득에서 결정되었기 때문입니다.
   1. 절제를 위한 z-plane이 아직 선택되지 않은 경우(2.4단계에서 설명함), "Live" 버튼을 누르고 절제할 형광 구조 또는 원하는 z-plane에 초점이 맞춰질 때까지 표본을 통해 초점을 맞춥니다.
3. 일반 이미지 매개변수가 설정되면 "Bleach" 단계에 액세스합니다(Figure 3C, 6)을 사용하여 특정 절제 구성 요소를 제어합니다.
   참고: A 레이저 강도의 조합 (Figure 3C, 8), 스캔 속도 및 3.2단계에서 설정한 평균(그림 3B, 4 5), 3.5단계에서 설정되는 반복 횟수(그림 3E, 12)은 ROI에서 UV 레이저의 전체 체류 시간을 결정하므로 표백 효율을 결정합니다.
   1. 표백 절차를 위해 405nm 레이저를 활성화하여 작동시킵니다(그림 3C, 8).
      참고: 앞서 언급한 설정에서 가장 성공적인 것은 실험 설정에서 60 - 80% 사이의 405nm 레이저 강도로 달성되었습니다. 이 레이저 출력은 기기에 따라 다르며 모든 컨포칼 설정에 따라 다릅니다.
   2. "확대"옵션 ( Figure 3C, 7) 스캔 필드를 줄여 선택한 ROI에서 표백 강도를 최대화하여 체류 시간을 최대화합니다. 또는 이 프로세스에 대해 선택한 소프트웨어의 "표백제 포인트" 옵션을 사용하십시오.
4. 하나 이상의 ROI를 선택합니다(Figure 3D, 10) 이미지 획득 창(그림 3D, 9). 예를 들어, 약 4 - 8 μm의 원형 그리기 도구를 사용하여 축삭돌기 언덕을 대상으로 합니다.
   참고: 절제 영역은 응용 분야에 따라 단일 픽셀에서 더 큰 영역까지 조정할 수 있습니다.
5. ROI를 설정한 후 "Time Course" 버튼(Figure 3E, 11) ROI가 스캔/절제될 사이클 수를 확인합니다(그림 3E, 12). "Pre-Bleach" 및 "Post-Bleach" 프레임을 원하는 대로 선택하면 표백 과정 직전과 직후의 전체 이미지를 전체적으로 볼 수 있습니다.
6. 필요한 모든 절제 매개변수를 설정한 후 "Run Experiment"(그림 3E, 13) 절제의 효율성을 모니터링합니다.
   참고: FRAP 설정에서는 적절한 레이저 여기(e., EGFP 발현 세포에 대한 488-nm 여기). 이러한 절제 전후 사진을 통해 ROI가 얼마나 만족스럽게 표백되었는지, 선택한 절제 매개변수가 얼마나 효과적이었는지를 빠르게 판단할 수 있습니다.
7. 레이저 강도를 조정하여 프로세스를 반복합니다(그림 3C, 8), 스캔 속도 및 평균(그림 3B, 4 5), 및 반복(그림 3E, 12) FRAP 완료 후에도 선택한 ROI가 여전히 높은 형광 강도를 보이는 경우 주기.

결과

재료