이 비디오는 광간섭의 사용을 보여줍니다. 단층촬영(OCT)은 고해상도 단면 이미지를 캡처하여 멀티웰 플레이트에서 종양 스페로이드를 모니터링합니다. OCT는 세포 구조에서 반사되는 빛을 분석하여 3D 모델을 구축하여 크기 및 모양과 같은 형태학적 특징을 평가하는 동시에 시간 경과에 따른 광 산란 변화를 기반으로 생존 가능한 세포와 생존 불가능한 세포를 구별합니다.
프로토콜
1. 세포 준비
자격을 갖춘 공급업체로부터 세포주를 확보합니다. 참고: 관심 세포주의 세포가 배양 배지에서 또는 기질(Matrigel과 같은 기저막 매트릭스)의 도움으로 스페로이드를 형성할 수 있는지 확인합니다. 문헌을 살펴보거나 사전 실험을 한 번 수행하여 확인합니다.
세포주 공급업체에서 제공하는 특정 절차에 따라 동결된 세포를 해동합니다. 일반적인 절차는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
25cm2 배양 플라스크에서 1-2 계대 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 세포를 3D 세포 배양에 사용할 준비가 됩니다.
세포의 건강 상태를 매일 모니터링하고 표준 조건(37°C, 5% CO2, 95% 습도)에서 세포를 유지합니다. 필요에 따라 미디어를 새로 고칩니다. 참고: 배양 배지는 Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)(4.5g/L 포도당), 1% 항생제-항진균제, 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 구성됩니다. 배양 플라스크에서 합류점에 도달하기 전의 하대배양 세포. 공급업체에서 제공하는 세포 배양 지침을 따르십시오. 일반적인 절차는 다른 곳에서 찾을 수 있습니다.
1mL의 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA, 0.5%)을 플라스크에 3분 동안 첨가하여 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 배양 배지를 첨가하여 트립신을 희석합니다.
세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮기고 500 x g 및 실온에서 5분 동안 원심분리합니다.
상층액을 제거하고 예열된 배양 배지 4mL로 세포를 재현탁합니다. 세포 농도를 측정하기 위해 세포 계수를 위해 검체 한 방울을 혈구계에 한 방울 떨어뜨립니다. 세포를 파종에 적합한 농도((예: , 3,000 cells/mL)로 희석합니다. 참고: 각 세포주와 각 유형의 멀티웰 플레이트(96-well, 384-well 또는 1536-well)에 대해 스페로이드의 초기 세포 농도를 최적화합니다.
종자 세포를 ULA(Ultra-Low Attachment) 둥근 바닥 멀티웰 플레이트에 넣습니다. 각 웰에 약 600개의 세포가 있도록 3,000cells/mL의 농도로 200μL의 세포 현탁액을 각 웰에 추가합니다.
실온(RT)에서 파종 직후 플레이트 어댑터를 사용하여 7분 동안 350 x g 또는 사용 가능한 가장 낮은 속도로 원심분리합니다. 참고: 원심분리기는 세포를 웰 중앙으로 모아 하나의 균일한 스페로이드를 형성하는 데 도움이 됩니다. 원심분리기 단계는 종양 스페로이드를 형성하기 위해 처음에 한 번만 수행됩니다. 종양 스페로이드가 자라기 시작할 때 반복되지 않습니다.
배양 인큐베이터에서 멀티웰 플레이트를 37°C 및 5% CO2로 유지하고 3일마다 배양 배지를 새로 고칩니다. 참고: 성장 시간은 3D 배양 조건에 따라 다를 수 있습니다. 본 연구에서는 96웰 플레이트의 U-87 MG 및 HCT 116 세포주 모두에 3,000 cells/mL가 사용되어 HCT 116 cell의 경우 스페로이드가 4-500일 만에 ~500μm까지 성장할 수 있습니다. 일반적인 3D 배양 프로토콜에 따라 다양한 스페로이드 모델에 대한 배지 보충제 및 성장 인자를 추가하는 것이 좋습니다.
종양 스페로이드의 성장에 대한 종단 연구를 위해 3-24일마다 종양 스페로이드의 광간섭 단층촬영(OCT) 이미징을 수행합니다. 참고: OCT 이미징에 권장되는 시점은 4일차, 7일차, 11일차, 14일차, 18일차, 21일차입니다.
2. 고처리량 OCT 이미징 플랫폼
참고: 이 연구에 사용된 맞춤형 OCT 이미징 시스템에 대한 자세한 내용은 그림 그림 1을 참조하십시오.
종양 스페로이드 이미징을 위한 OCT 시스템에 적합한 광대역 광원을 선택하십시오. 참고: 여기서는 중심 파장이 ~1,320nm이고 대역폭이 110nm인 초발광 다이오드(TAG_220그림 1A, 그림 1A{{}}, B)를 광대역 광원으로 사용했습니다.
회로도에 따라 OCT 시스템의 기준 암과 샘플 암을 구성합니다(자세한 내용은 TAG_240 TAG_239 TAG_238그림 1A, B 참조). 테이블의재료는 OCT 시스템을 구성하는 데 필요한 광학 구성 요소를 나열합니다. reference arm과 sample arm의 광학 경로 길이가 밀접하게 일치하는지 확인합니다.
OCT의 분광계 설계에 대한 자세한 내용은 시준기, 격자, F-세타 렌즈 및 라인 스캔 카메라(설정은 그림 {{TAG_277 TAG_275}}{{TAG_276 TAG_278}} 참조)를 포함한 분광계를 구성합니다.또는 광원의 중심 파장과 일치하는 상용 분광계를 선택합니다. 분광계가 전체 레이저 대역폭을 커버하고, 높은 광자 수집 효율을 달성하고, 간섭 패턴의 느린 세척을 제공할 수 있도록 올바르게 정렬되어 있는지 확인하십시오.
샘플 암 파워, 총 이미징 깊이, 깊이 의존적 민감도, 축 분해능, 초점 심도 및 측면 해상도와 같은 메트릭을 포함하여 OCT 시스템의 성능을 특성화합니다. 약한 반사경(예: {{TAG_286 TAG_289}}{{TAG_287 TAG_290}}{{TAG_288 TAG_291}}, 중립 밀도 필터가 있는 거울)을 샘플로 배치하여 깊이 종속 민감도, 축 해상도 및 초점 심도를 측정합니다. 미국 공군(USAF) 해상도 테스트 차트 대상을 샘플로 배치하여 측면 해상도를 확인합니다.
서로 다른 웰의 종양 스페로이드를 이미지화하기 위해 다중 웰 플레이트의 수평 이동을 제공하는 전동 번역 단계를 선택합니다(TAG_300 TAG_299 TAG_298그림 1B 참조). 이동 범위가 108mm x 72mm보다 큰 스테이지를 사용하여 다중 웰 플레이트의 모든 웰을 완전히 스캔할 수 있습니다. 소프트웨어 제어 기능이 있는 2차원(2D) 또는 3차원(3D) 전동 변환 스테이지를 사용하여 각 웰의 정확한 위치를 파악하고 고처리량 이미징을 위한 OCT 시스템을 자동화할 수 있습니다. 위치
플레이트 어댑터를 사용하거나 플레이트 홀더(3D 프린팅을 통해)를 설계하여 멀티웰 플레이트를 고정된 위치에 고정합니다.
OCT 이미징을 수행하기 전에 2D 틸팅 스테이지와 변환 스테이지에 장착된 회전 스테이지(그림 TAG_327 TAG_326 TAG_325참조)를 사용하여 멀티웰 플레이트의 기울기 및 회전을 수정하여 다른 웰에서 초점 평면의 변동을 최소화합니다. OCT 이미지에서 상대적 위치를 모니터링할 때 D2, D11, B6, D6 및 G6을 안내 웰로 사용합니다(TAG_330 TAG_329 TAG_328그림 1A{{TAG_331).
웰이 OCT 이미지에서 동일한 수평 위치에 유지되도록 가장자리가 스테이지 이동 방향과 평행이 되도록 플레이트의 회전을 조정합니다(TAG_342 TAG_341 TAG_340그림 1E). OCT 이미징을 위해 웰이 동일한 수직 위치에 유지되도록 플레이트의 기울기를 광학 테이블과 평행하게 조정합니다(그림 1F). 참고: 틸팅 각도와 초점을 조정하면 모든 웰에 대한 OCT 이미지 품질을 최적화하는 데 도움이 됩니다. 그러나 다른 웰에서 배양 배지의 높이의 변화는 광학 경로의 변화를 유발할 수 있으며, 이는 스페로이드 이미지의 초점을 흐리게 할 수 있습니다. 최적화된 이미지 품질을 달성하기 위해 OCT 이미징의 초점면을 제어하기 위해 자동 초점을 구현할 수 있습니다. 조정 단계는 다음과 같은 문제로 인해 종양 스페로이드의 낮은 OCT 이미지 품질을 해결하지 못합니다: 초기 파종 위치로 인한 스페로이드 감소; 생물 가공 세포 외 매트릭스에 매립될 때 스페로이드 상승; 우물 바닥의 높이에 큰 변화가 있는 열악한 플레이트 품질. 자동 초점 또는 자체 정렬 기능을 통한 추가 소프트웨어 제어를 구현하여 OCT 이미징 시스템의 성능을 최적화할 수 있습니다.
각 유정에서 순차적으로 데이터를 수집하기 위해 맞춤형 컴퓨터 프로그램이 OCT 이미지 획득 및 스테이지 이동을 제어합니다.
3. 종양 스페로이드의 OCT 스캐닝 및 처리
종양 스페로이드의 OCT 이미징 당일, 인큐베이터에서 멀티웰 플레이트를 제거합니다. OCT 이미징 시스템 아래로 전송하고 플레이트 어댑터 위에 놓습니다. 참고: TAG_391 TAG_390 TAG_389종양 스페로이드의 OCT 이미징은 폴리스티렌 플레이트 뚜껑을 켜거나 끈 상태에서 수행할 수 있습니다. 그러나 우물에서 증발하여 뚜껑에 묻은 응결은 광 투과에 영향을 미치고 광 경로를 왜곡시켜 스페로이드에서 최적의 OCT 이미지를 생성하지 못할 수 있습니다.
평행 이동 스테이지의 z 방향을 따라 이동하여 플레이트의 높이를 조정합니다. 각 스페로이드의 상단 표면 아래 ~100–200 μm에서 초점면 위치를 유지하여 균일하지 않은 깊이 초점 프로파일의 영향을 최소화합니다.
맞춤형 소프트웨어에서 적절한 OCT 스캐닝 범위(예: {{TAG_404 TAG_407}}{{TAG_405 TAG_408}}{{TAG_406 TAG_409}}, 1mm x 1mm)를 설정하여 진행 단계에 따라 전체 종양 스페로이드를 커버합니다. 매개변수 저장을 클릭하여 설정을 저장합니다.
맞춤형 소프트웨어를 사용하여 스페로이드가 포함된 플레이트의 모든 웰에 대해 종양 스페로이드의 3D OCT 이미지를 하나씩 획득할 수 있습니다. 미리보기 버튼을 클릭하여 미리보기 이미지를 확인하고 획득 버튼을 클릭하여 OCT 이미지를 획득합니다. 참고: 스테이지가 움직이지 않을 때 OCT 스페로이드 데이터가 수집되었는지 확인하십시오. 스페로이드는 일반적으로 U-바닥 우물의 중앙에 위치합니다. 그러나, 배양 배지에서 스페로이드의 관성으로 인해 스테이지가 가속 또는 감속할 때 배양 배지에서 스페로이드가 이동될 수 있습니다.
종양 스페로이드의 3D OCT 데이터 세트를 처리하여 사용자 정의 C++ 처리 코드로 OCT 구조 이미지를 생성합니다. OCT 데이터의 사후 처리에 대한 순서도는 그림 2A를 참조하십시오. 참고: 생성된 3D OCT 구조 이미지는 TAG_466 TAG_465 TAG_464그림 3A를 참조하십시오.
3차원 모두에서 픽셀 크기를 보정합니다. 보정된 스케일에서 OCT 구조 이미지의 크기를 다시 조정합니다. 참고: OCT 이미지의 축 방향(z 방향)의 거리는 reference arm과 sample arm 사이의 광학 경로 차이를 측정합니다. 따라서 샘플의 굴절률(n)은 재스케일링을 위해 축 방향의 픽셀 크기를 보정할 때 고려해야 합니다. 본 연구에서는 n = 1.37을 종양 스페로이드의 굴절률로 사용합니다.
스페로이드의 중심을 가로지르는 3개의 단면 XY, XZ 및 YZ 평면에서 2D OCT 이미지를 사용하여 스페로이드 이미지의 콜라주를 생성합니다. 스페로이드 이미지 콜라주의 대표적인 출력은 TAG_495 TAG_494 TAG_493그림 4C–E를 참조하십시오. MATLAB 함수 dftregistration을 사용하여 모든 스페로이드에 대해 이미지 정합을 수행하여 모든 스페로이드의 중심이 거의 동일한 위치에 있는지 확인합니다.
상용 또는 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 스페로이드의 3D 렌더링을 얻을 수 있습니다. 위치 참고: 다음 단계는 상용 소프트웨어를 사용하여 종양 스페로이드의 3D 렌더링을 얻는 방법을 보여줍니다.
3D OCT 데이터를 소프트웨어에 로드합니다.
Surpass 패널을 클릭합니다. 그런 다음 새 볼륨 추가를 클릭합니다. 3D 렌더링에 사용할 블렌드 모드를 선택합니다.
마우스 포인터를 사용하여 이미지를 드래그하여 시야각을 조정합니다.
4. 3D 종양 스페로이드의 형태학적 정량화
참고: MATLAB의 사용자 정의 작성 코드는 이 정량화를 처리합니다. 실행 버튼을 클릭하여 프로세스를 시작합니다. 스페로이드의 형태학적 정량화 단계의 순서도는 TAG_579 TAG_578 TAG_577그림 2B를 참조하십시오.
스페로이드 직경, 높이 및 직경 기반 부피를 정량화합니다.
스페로이드의 중심을 가로지르는 3개의 단면 XY, XZ, YZ 평면에서 2D OCT 이미지를 선택합니다.
XY 및 XZ 평면에서 각각 회전 타원체의 지름과 높이를 측정합니다.
종양의 구형 모양을 추정하여
를 사용하여 직경 기반 스페로이드 부피를 계산합니다.
복셀 기반 스페로이드 부피를 정량화합니다.
스페로이드의 OCT 구조 데이터에 3D 평균 필터를 적용하여 스페클을 제거합니다.
Canny edge detection filter를 사용하여 종양 스페로이드 영역과 웰 바닥을 분리하는 적절한 임계값을 사용하여 프레임별로 종양 스페로이드를 분할합니다.
3D 데이터에 대한 그룹 연결 복셀(내장 함수: bwconncomp 참조).
각 그룹에 대해 그룹의 각 연결 복셀과 스페로이드 중심(수동으로 선택) 사이의 평균 거리를 계산합니다. 스페로이드 영역을 최소 평균 거리를 가진 그룹으로 식별합니다.
스페로이드 영역 내의 복셀 수를 세고 개별 복셀의 실제 부피(부피/복셀)를 곱하여 스페로이드의 총 부피를 산출합니다.
5. 3D 종양 스페로이드의 사세포 영역 검출
참고: 균일한 매질에서 깊이(I(z))의 함수로 검출된 OCT 후방 산란 강도는 다음과 같이 설명될 수 있습니다. 비어-램버트 법칙:
여기서 z는 깊이를 나타내고, μ는 광학 감쇠 계수, I0는 샘플에 대한 인시던트 강도입니다. 따라서 파생된 광학 감쇠 계수는 다음과 같이 표현될 수 있습니다:
OCT 이미지는 종종 로그 스케일로 표시되기 때문에 OCT 강도 프로파일의 기울기를 검색하여 광학 감쇠 계수를 도출할 수 있습니다. 광학 감쇠 맵 생성의 순서도는 TAG_728 TAG_727 TAG_726그림 2C를 참조하십시오.
세분화를 수행하여 스페로이드 외부의 원치 않는 영역을 제거합니다. 3D 평균 필터를 수행하여 OCT 이미지에 내재된 스페클 노이즈를 억제합니다.
특정 깊이 범위(이동 창)에 걸쳐 로그 스케일 OCT 강도 프로파일을 선형 피팅하고, 기울기를 추출하고, 기울기에 -1/2을 곱하여 픽셀 단위 광학 감쇠 계수를 얻습니다. 참고: 분할된 스페로이드 영역 내의 각 복셀의 감쇠 계수는 10복셀 깊이 창(깊이 ~40μm)에서 OCT 강도 프로파일의 기울기를 기반으로 계산되며, 복셀은 창 중앙에 있습니다.
분할된 스페로이드 영역의 모든 복셀에 대한 광학 감쇠 계수가 계산될 때까지 프레임의 각 축 스캔과 분할된 스페로이드 영역을 포함하는 3D 데이터 세트의 각 프레임에 위의 방법(5.1 및 5.2단계)을 적용합니다.
이진 임계값 설정을 수행하여 고감쇠 영역을 강조 표시합니다. 원본 이미지에서 이진화된 광학 감쇠 맵을 강조 표시하여 데드 셀 영역(블렌딩)에 레이블을 지정합니다. 혼합된 감쇠 맵의 3D 렌더링 이미지를 생성하여 데드 셀 영역의 3D 분포를 시각화합니다.
