원자력 현미경을 사용하여 마우스 뇌에서 분리된 폴리솜 이미징

Abstract

출처 : Lunelli, L., et. al. 원자력으로 뇌 폴리솜 들여다보기 현미경.J. Vis. 특급.(2016).

이 비디오는 원자력 현미경을 사용하여 폴리솜의 이미징을 보여줍니다. 니켈 이온으로 코팅된 운모 시트는 리보솜이 부착된 RNA를 고정합니다. 샘플을 세척하고 건조시켜 현미경 스테이지에 장착합니다. 캔틸레버 팁은 샘플 표면을 스캔하고 레이저 편향을 기록하여 토폴로지를 매핑합니다. 소프트웨어는 왜곡을 수정하고 고해상도 폴리솜 구조를 시각화하는 데 사용됩니다.

Protocol

주의: 샘플의 RNA 분해를 방지하려면 RNase 오염을 최소화하기 위해 DEPC 처리된 물을 사용하여 모든 완충액을 준비하십시오.

1. 전뇌에서 폴리솜 준비

1. 뇌 조직 채집(15분)
   1. 야생형 마우스 균주 C57BL/6을 CO₂로 5분 동안 질식시킵니다. 두개골에서 뇌를 조심스럽게 해부하고 조직을 1.5ml 튜브에 넣은 다음 즉시 액체 질소에 넣으십시오. 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
2. 용해물 준비 (30 분)
   1. 절구를 사용하여 전체 뇌 조직을 분쇄하고 액체 질소 아래에서 절굿공이를 만듭니다.
   2. 약 25mg의 분말을 차가운 미세원심분리 튜브에 옮기고 즉시(분쇄된 조직의 해동을 피하기 위해) 0.8ml의 Lysis Buffer (를 추가하고 표 1 참조) 을 추가하고 빠르게 위아래로 25회 피펫팅하여 세포를 파괴합니다.
   3. 12,000 x g에서 4°C에서 1분 동안 튜브를 원심분리하여 세포 파편을 펠릿화합니다.
   4. 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브를 얼음 위에 15분 동안 유지합니다.
   5. 12,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하여 핵과 미토콘드리아를 펠릿화합니다.
   6. 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   7. 상등액은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하거나 즉시 사용하십시오.
3. 자당 그래디언트 준비 및 원심분리(2시간 30분)
   1. RNase-free 물(디에틸피로카보네이트 처리수(DEPC-물) 또는 상업용) 및 3% H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O 솔루션.
   2. 튜브를 얼음에 넣고 각 튜브 바닥에 차가운 50% 자당 용액 5.5ml를 추가합니다(자당 용액은 표 1 참조). 15% 자당 용액을 한 방울씩 조심스럽게 첨가하고 튜브가 완전히 채워질 때까지 날카로운 계면을 유지하기 위해 계면 가까이에 유지합니다. 튜브가 완전히 채워지면 기포 형성을 방지하기 위해 고무 마개로 닫으십시오.
   3. 추운 방에서 튜브를 부드럽게 수평으로 놓고 2시간 동안 이 위치를 유지합니다. 이 시간이 지나면 튜브를 천천히 수직 위치로 곧게 펴고 얼음 위에 올려 놓습니다. 이제 그라디언트를 사용할 준비가 되었습니다. 대안적으로, 종래의 그래디언트 형성제를 사용하여 15-50% 슈크로스 그래디언트를 준비한다.
   4. 차가운 방에서 그래디언트 상단에서 1.0ml를 조심스럽게 제거하고 자당을 세포질 용해물(즉, 1.2단계에서 얻은 상등액)과 한 방울 한 방울 오버레이합니다.
   5. 튜브를 스윙 버킷 로터의 버킷으로 조심스럽게 내립니다. 초원심분리기를 사용하여 4°C에서 180,000 x g에서 100분 동안 그래디언트를 원심분리합니다.
   6. 원심분리 후 4°C에서 20분 동안 튜브를 버킷에 넣어 그래디언트를 안정화합니다.
4. 자당 그래디언트 분획(2시간)
   1. 초원심분리기 로터에서 초원심분리기 튜브 하나를 조심스럽게 제거하고 밀도 구배 분획 시스템의 수집기 장치에 장착합니다. UV/VIS 검출기로 260nm에서 흡광도를 모니터링하기 위해 1ml 분획을 수집합니다( 그림 1 상단 패널 참조). 수집된 조각을 얼음 위에 보관하십시오.
   2. 관심 분획의 30-40 μl의 부분 표본을 준비합니다. 사용할 때까지 -80°C에서 보관하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 두 번 이상의 동결-해동 주기를 거친 부분 표본 또는 자당 분획을 사용하지 마십시오(그림 1 하단 패널 참조).

2. 원자력 현미경을 위한 시료 준비(3시간)

1. 테이프를 사용하여 운모 시트를 벗겨냅니다.
2. 운모 시트를 DEPC-water로 3-4회 씻고 작은 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 공기를 사용하여 표면을 건조시킵니다.
3. 운모를 200μl의 1mM NiSO₄로 덮고 RT에서 3분 동안 배양합니다.
4. 니켈 용액을 제거한 다음 공기를 사용하여 표면을 건조시킵니다. 운모와 함께 페트리 접시를 얼음 위에 올려 4°C에서 향후 모든 단계를 수행합니다.
5. 1.4.2에서 얻은 부분 표본을 얼음 위에서 해동하고 모든 샘플을 운모에 한 방울씩 부드럽게 첨가합니다. 100-200 μl 팁을 사용하여 샘플을 운모의 전체 표면에 펴 바릅니다. 얼음 위에서 시료를 3분 동안 배양합니다.
6. 200μl의 콜드 버퍼-AFM (참조, , 표 1)을 한 방울 한 방울 덮고 얼음 위에서 1시간 동안 배양합니다.
7. 액체에서 이미징
   1. Buffer-Atomic Force Microscope(AFM)를 조심스럽게 제거하고 운모 시트를 200μl의 차가운 Buffer-AFM으로 3-4회 세척하여 과도한 자당을 제거합니다. 그런 다음 운모 시트를 차가운 세척 용액( 표 1 참조)으로 3번 세척하여 운모 표면을 몇 마이크로리터의 용액으로 덮습니다.
   2. 포인트 3(이미지 획득)으로 이동합니다.
8. 공기 중 이미징
   1. Buffer-AFM을 조심스럽게 제거하고 운모를 200μl의 차가운 Buffer-AFM으로 3-4회 세척하여 과도한 자당을 제거합니다. 그런 다음 차가운 세척액(표 1 참조)으로 운모를 3회 세척하고 종이를 사용하여 여분의 물을 배출합니다.
   2. 위치 샘플을 그대로 두십시오.amp페트리 접시 상단이 부분적으로 열린 상태에서 화학 후드 아래에서 건조시킵니다. 2시간 후 페트리 접시를 닫고 실온(RT)에서 보관하세요. 수년간 안정적이므로 2-3시간 후에 샘플을 측정하십시오.

3. 이미지 획득 (열 안정화 후 이미지당 15분)

참고: 운모에 고정된 폴리솜은 AC 모드를 사용하여 공기 또는 액체에서 이미지화할 수 있습니다.

1. 양면 테이프를 사용하여 샘플 홀더에 운모를 부착합니다.
2. 샘플 홀더를 AFM s에 삽입하십시오.tage 제조업체의 지시에 따라. 액체에서 이미징할 때는 가능하면 샘플을 25°C 미만의 온도로 유지하여 시간에 따른 폴리솜 안정성을 높이십시오.
3. AC 이미징에 적합한 캔틸레버를 선택하고 제조업체의 지침에 따라 팁 홀더에 장착하십시오. 여기에서 공기 이미징의 경우 2-20N/m, 액체 이미징의 경우 약 0.1N/m 사이의 힘 상수를 가진 캔틸레버를 사용합니다.
4. 캔틸레버의 레이저 스폿을 조정하고 사분면 감지기 신호를 영점화합니다.
5. 적절한 구동 주파수를 선택하고 10-20nm의 진폭으로 캔틸레버를 구동합니다.
6. 팁이 표면에 맞물릴 때까지 샘플에 접근합니다.
7. 2x2μm의 스캔 영역을 선택하고, 최소 512x512 픽셀 이미지(픽셀 너비 < 4nm)를 획득하고, 라이브 배경 빼기 모드와 20-25nm의 Z 스케일을 선택합니다.
8. 이미지를 검사하여 공기 중에서 획득할 때 10 및 15nm 사이의 높이, 액체 상태에서 25 및 30nm 사이의 높이와 25-30nm 범위의 너비를 특징으로 하는 둥근 물체의 존재를 확인합니다. 날카로운 물체가 시각화될 때까지 설정값 및 피드백 매개변수를 조정합니다. 배경은 일부 2-4nm 높이의 물체와 함께 좋은 샘플에서 비교적 평평하게 나타나야 합니다(TAG_379 TAG_378 TAG_377그림 2A 및 B{{TAG_380 참조).
9. 이미지가 좋아 보이면 (포인트 3.8에 표시된 대로) 서로 다른 샘플 영역에서 여러 개의 2x2 미크론 스캔을 획득하십시오.
10. (선택 사항). 필요한 경우 선택한 폴리솜의 고해상도 이미지를 획득합니다(TAG_395그림 2C{{TAG_397 TAG_396 TAG_399}} 참조).
11. 소프트웨어 보정(평면 빼기 및 라인별 보정 알고리즘)을 적용하여 AFM 이미지를 수정하고 임의의 기울기 및 드리프트 효과를 제거합니다.

4. 데이터 분석(이미지당 30분)

1. 무손실 압축 형식(예: TIFF 형식)을 사용하여 우선적으로 ImageJ(선택 사항: 배율 적용)로 이미지를 내보냅니다(그림 3A{{TAG_425 TAG_424 TAG_423 TAG_426}} 참조).
2. ImageJ 매크로 도구 집합 RiboPick.ijm(ImageJ 매크로/도구 세트 하위 디렉토리에 복사됨)을 사용하여 폴리솜의 리보솜을 세고( 그림 3B 참조) 샘플의 통계 속성을 계산합니다(그림 TAG_441 3C{{TAG_443 TAG_442 TAG_445}} 참조).
   1. 프로그램을 초기화하는 <이미지 읽기> 도구를 사용하여 이미지 로드를 시작합니다.
   2. 표준 ImageJ <점 선택> 도구를 사용하여 리보솜 중심을 선택합니다(Shift + 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하면 리보솜을 다중 선택할 수 있음). 선택한 리보솜을 <mark> 도구로 표시합니다. 리보솜 좌표는 사용자 지정 텍스트 창에 나타납니다.
   3. 동일한 폴리솜에 더 많은 리보솜을 추가하고 4.2.2 포인트에 표시된 절차를 반복합니다.
   4. 도구를 사용하여 잘못 표시된 리보솜을 제거합니다(마지막으로 추가된 리보솜에서 첫 번째 리보솜으로 제거 시작 - 현재 폴리솜에서만 해당).
   5. 폴리솜이 완성되면 도구를 사용합니다. 폴리솜 숫자가 이미지에 오버레이로 추가되면 텍스트 창이 업데이트됩니다.
   6. 를 사용하여 리보솜 좌표 파일(이미지의 기본 단위가 사용됨)과 선택한 리보솜 및 폴리솜을 요약하는 PNG 이미지를 작성합니다. 원본 이미지가 저장되지 않고 닫힙니다.

표 1. 버퍼.

10 mM Tris–HCl, pH 7.5

100 μg/ml 시클로헥시미드

위치 버퍼	작곡{{TAG_526{{TAG_527	{{TAG_529{{TAG_530응용 프로그램
용해 버퍼	용해물 (1.1)
	10 mM NaCl	{{TAG_ 577 mM MgCl
	10 mM MgCl2{{TAG_590
	1% Triton-X100
	1% Na-데옥시콜레이트
	0.4 U/ml RNase 억제제
{{ TAG_641}}	1 mM DTT
{{TAG_655	{{TAG_6580.2 mg/ml 시클로헥시미드
	TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50% 자당 용액	{{}}	자당에서 50% (v) 자당 그래디언트 준비 (1.2)
	100 mM NaCl
	10 mM MgCl2{{ TAG_733}}
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
15% 자당 용액{{TAG_760	{{ TAG_764}}	{{}}에서 15%(w/v) 자당 준비(1.2){{TAG_774
	100 mM NaCl
10 mM MgCl2
	10 mM Tris/HCl pH 7.5
니켈 용액	1 mM NiSO4	AFM에 대한 샘플 준비 (2)
버퍼-AFM	100 mM NaCl	AFM에 대한 샘플 준비 (2)
	10 mM MgCl2
	100 μg/ml 시클로헥시미드{{TAG_909
	10 mM Hepes{{ TAG_924}}
	3% (w/v) 자당{{TAG_936{{TAG_937 pH = 7.4{{TAG_942
세탁 솔루션	DEPC-Water	{{TAG_967AFM에 대한 시료 준비 (2)

{{ TAG_548}}{{ TAG_610}}{{TAG_624{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}TAG_978{{ TAG_985}}

Results

Materials