마우스 뇌의 대뇌 해면상 기형 병변에 대한 조영제 강화 마이크로 CT 이미징

초록

출처: Choi, J. P. et al. 마우스 모델에서 대뇌 해면 기형의 유도 및 마이크로 CT 이미징.J. Vis. 특급 (2017)

이 비디오는 쥐 뇌에서 대뇌 해면상 기형(CCM) 병변을 시각화하기 위해 마이크로 CT 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 뇌 조직에서 CCM 병변의 밀도와 위치를 평가하기 위해 샘플 준비, 이미징 및 3D 이미지 재구성 단계를 자세히 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔을 위한 샘플 준비

1. 이산화탄소 질식을 통해 P8에서 신생아 새끼를 안락사시킵니다.
2. 10mL 주사기에 인산염 완충 식염수(PBS)에 2% 파라포름알데히드 3mL가 함유된 29게이지 바늘을 마우스 심장의 심실에 삽입하여 심장 내 관류를 수행합니다.
   주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 보호구를 착용하십시오.
3. 가위를 사용하여 몸에서 머리를 분리합니다. 가위로 머리의 피부를 모두 제거하고 집게를 사용하여 두개골을 벗겨내어 뇌 전체를 절개합니다.
4. 실체현미경으로 7.82배 배율, 1배 게인, 0.6 감마 및 20ms 노출 시간으로 뇌 이미지를 촬영합니다.
5. PBS 용액에 4% 파라포름알데히드로 절개된 뇌를 하룻밤 사이에 고정합니다.
   주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 보호구를 착용하십시오.
6. 다음 날에는 겸자를 사용하여 뒷뇌를 분리하고 PBS 용액으로 씻습니다.
7. Lugol의 요오드 용액에서 뒷뇌를 48시간 동안 배양합니다.
8. 배양 후 뒷뇌를 잠시 자연 건조하여 과도한 Lugol의 요오드 용액을 제거합니다.
9. Lugol의 요오드로 염색된 뒷뇌를 0.65mL 마이크로 원심분리기 튜브에 포장하고 조직 수축을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름으로 완전히 밀봉합니다(그림 1A).
10. 스캔 중에 움직이지 않도록 스폰지가 있는 5mL 플라스틱 튜브에 미세 원심분리기 튜브를 넣습니다(그림 1B).

2. 마우스 뇌의 대뇌 해면체 기형(CCM)의 마이크로 CT 스캔

1. 마이크로 CT 시스템의 알루미늄 홀더에 튜브에 포장된 hindbrain을 수직으로 장착합니다.
2. 스캔 매개변수를 540 프로젝션과 50 kV 및 10 W의 소스 조건에서 2초의 노출 시간으로 설정하여 단층 촬영 데이터 세트(이미지 해상도 9.5 μm/픽셀)를 획득합니다.
3. 스캔의 방사선 사진은 마이크로 CT 시스템에서 제공하는 하드웨어 기반 투영 재구성 소프트웨어에 의해 자동으로 재구성되어 16비트 축 슬라이스("TXM" 파일)의 이미지 시리즈를 생성합니다.

3. Micro-CT 데이터 세트 분석

1. 3D 분석 소프트웨어에서 재구성된 이미지 파일("TXM" 파일)을 열고 "볼륨 렌더링" 기능을 사용하여 뇌를 시각화합니다.
2. "bounding box" 및 "clipping plane" 기능을 사용하여 뒷뇌를 원하는 방향으로 변환합니다.
3. 확장 모드에서 변환된 이미지를 다시 샘플링하고 복셀 크기를 유지합니다.
4. 변환된 이미지(3.3)에 "edit new label field"를 만들고 그레이스케일 강도를 사용하여 hindbrain만 강조 표시합니다.
5. 강조 표시된 영역을 추가하고 "레이블 분석"을 실행하여 전체 hindbrain의 측정값을 얻습니다(i.e., 총 부피 및 면적). 측정값을 Excel 파일로 내보냅니다.
6. "isosurface rendering" 기능을 사용하여 뒷뇌를 시각화합니다.
7. 변환된 이미지에 또 다른 "edit new label field"를 만들고 그레이스케일 강도를 사용하여 병변이 있는 영역을 강조 표시합니다.
8. 강조 표시된 영역을 추가하고 "레이블" 분석을 실행하여 뒷뇌 내의 병변 측정값을 얻습니다(i.e., 총 부피 및 면적). 측정값을 Excel 파일로 내보냅니다.
9. Generate surface" 및 "surface view" 기능을 사용하여 병변을 시각화합니다.
10. 원하는 방향에서 후뇌의 이미지를 스냅샷으로 찍거나 병변의 3D 시각화를 위한 동영상을 생성합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
4-hydroxy tamoxifen	시그마-알드리치	H6278	Cdh5-CreErt2를 활성화하려면
Corn oil	Sigma-Aldrich	C8267-500ML	4-hydroxy tamoxifen을 희석하려면<
Stereomicroscope	Leica	M205FA	거시적 이미지를 찍으려면
Lugol의 요오드 솔루션	시그마-알드리치	L6146	대비를 위한 샘플 염색 micro-CT
플라스틱 파라핀 필름	Parafilm	PM992	패키지하려면 samples
Micro-CT	Xradia	MicroXCT-400	Micro-CT
3D 렌더링 소프트웨어	FEI 시각화 과학 그룹	Avizo 3D 이미지 처리 소프트웨어	micro-CT 스캔을 분석하기 위해

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