1. 분석 플레이트, 스톡 솔루션 및 OPC 기본 미디어 준비
참고: 여기에 설명된 쥐 OPC 염기(Sato) 배지는 이전에 발표된 연구에서 파생되었습니다. 대안적인 배지 제형은 또한 이러한 절차와 양립할 수 있다.
- poly-L-lysine(PLL)을 멸균 탈이온수에서 10μg/ml의 농도로 재현탁합니다. 희석된 PLL의 400μl를 검은색 벽의 투명한 바닥 24웰 조직 배양 등급 접시의 각 웰에 피펫팅합니다.
- 조직 배양 접시를 37°C 조직 배양 인큐베이터에서 2시간 동안 또는 4°C 냉장고에서 하룻밤 동안 코팅합니다.
- 플레이팅 최소 20분 전에 코팅된 접시에서 PLL을 흡입하십시오. 조직 배양 후드에 뚜껑이 부분적으로 열린 상태로 24개의 웰 플레이트를 배치하여 나머지 PLL이 웰에서 건조되도록 합니다. 분리된 OPC를 도금하기 전에 웰이 완전히 건조되었는지 확인합니다. 셀은 액체 PLL이 있는 플라스틱에 부착되지 않습니다.
- 준비 N-Acetyl-L-cysteine(NAC) 원액(1,000x): 100mg 용해N-Acetyl-L-cysteine(NAC) in 20 ml of Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM). 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
- 하이드로코르티손 원액 준비(1,000x): 하이드로코르티손 1mg에 에탄올 1ml를 넣고 소용돌이쳐 녹입니다. DMEM 19ml를 넣고 용액, 분취액을 혼합하여 -20°C에서 보관합니다. 염기 배지에 하이드로코르티손을 추가하면 신경교세포의 생존이 향상되는 것으로 나타났습니다.
- d-비오틴 원액 준비(5,000x): d-비오틴 2.5mg을 인산염 완충 식염수(PBS) 50ml에 용해시킵니다. 용해를 돕기 위해 0.1 N NaOH의 1-2 x 5 μl 방울을 첨가하십시오. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
- 인슐린 원액 준비(100x): 인슐린 25mg을 조직 배양 등급 물 50ml에 용해시킵니다. 250 μl의 1 N HCl을 첨가하고 용액이 투명해질 때까지 혼합합니다. 0.22μm 필터로 멸균하고 4°C에서 최대 6주 동안 보관합니다.
- 사토 스톡 솔루션 준비 (100x) :
- 프로게스테론 원액 준비(25μg/μl): 100μl의 에탄올에 2.5mg의 프로게스테론을 용해합니다.
- 아셀렌산나트륨 원액(400ng/μl) 준비: 아셀렌산나트륨 4mg을 0.1N NaOH 100μl에 용해시킵니다. DMEM 10ml를 넣고 섞습니다.
- DMEM 100ml에 인간 아포-트랜스페린 1g, 소 혈청 알부민 1g, 푸트레신 160mg을 넣고 완전히 녹일 때까지 섞는다. 프로게스테론 원액 25μl, 아셀렌산나트륨 원액 1,000μl를 넣고 섞는다. 부분 표본은 -20 °C에서 보관하십시오.
- OPC 기본 배지 준비: DMEM 100ml당(4.5g/L D-글루코스, L-글루타민 및 110mg/L 피루브산 나트륨 포함), NAC 100μl, 하이드로코르티손 100μl, d-비오틴 20μl, 인슐린 1ml, 사토 스톡 1ml, 미량 원소 B 100μl, B-27 보충제 2mL(50개) 및 페니실린/스트렙토마이신 1ml(100개)를 추가합니다. 0.22μm 필터로 멸균하고 4°C에서 보관하십시오.
- 혈소판 유래 성장 인자 AA (PDGF-AA) 원액 (1,000x) 준비 : PBS 12.5ml에 250 μg을 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)과 함께 용해시켜 20 μg / ml 용액을 만듭니다. 부분 표본은 -80 °C에서 보관하십시오.
- OPC 증식 배지 준비: 20ng/ml PDGF-AA가 보충된 OPC 기본 배지.
- OPC 분화 배지 준비: 45nM 트리요오드티로닌이 보충된 OPC 기본 배지.
- 컬럼 완충액 준비: PBS 500ml에 BSA 2.5g과 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2ml를 넣고 pH를 7.2로 조정합니다. 0.22μm 필터로 멸균하고 4°C에서 보관하십시오.
2. 4% 파라포름알데히드를 사용한 OPC 분화 및 고정 유도
참고: 소분자가 희소돌기아교 형성에 미치는 영향을 테스트할 때, 당사는 일상적으로 약물을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 1,000x 스톡을 준비한 다음 -80°C에서 보관하고 SATO 배지에 직접 희석하여 0.1% DMSO의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. 우리는 이 DMSO 농도를 사용하여 OPC 증식 또는 분화에 대한 변화를 관찰하지 못했습니다(데이터는 표시되지 않음).
- OPC 기본 매체를 37°C로 예열하고 약물 처리 재고를 실온으로 해동합니다. 중복 처리를 수행하는 경우 1.5ml 튜브에 치료 그룹당 약 1.25ml의 배지를 준비합니다. 3회 샘플의 경우 2ml 용량의 원심분리기 튜브를 사용하여 슬랙을 고려합니다.
- 처리 원료를 OPC 기본 매체에 직접 희석하여 복제 웰용 처리 마스터 믹스를 준비합니다. 각 마스터믹스를 짧게 소용돌이치거나 부드럽게 혼합하여 트리트먼트의 균일한 분포를 보장합니다.
- 45 nM 트리요오도티로닌 준비 (T3) 포지티브 컨트롤로, 적절한 차량을 네거티브 컨트롤로 사용합니다. 희석 10 mM T3 OPC 기본 배지 1ml에 1:1,000을 비축한 다음 필요한 경우 DMSO의 최종 농도를 줄이기 위해 처리 마스터 믹스에서 추가로 희석합니다.
- 세포가 건조되지 않도록 한 번에 한 처리 그룹씩 배양 웰의 배지를 흡인합니다. 유리 파스퇴르 피펫 끝에 200μl 피펫 팁을 사용하여 우물 측면에서 배양물로 검은색 물질이 긁히는 것을 방지합니다.
- 1ml 피펫을 사용하여 웰 측면을 따라 500μl의 트리트먼트 마스터믹스를 천천히 추가합니다.
- 원하는 기간 동안 배양물을 배양하고 2-3일마다 새로운 처리 배지와 완전한 배지 교환을 수행합니다. 우리는 일상적으로 30-40 % MBP + culture 차별화 미디어.
- 원하는 처리 기간이 끝나면 새로운 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비하거나 냉동 육수를 실온에서 해동합니다. CAUTION: PFA는 독성이 매우 높으므로 흄 후드에서 준비해야 합니다.
- 배지를 흡인하고 웰 측면에 400μl의 PFA를 천천히 첨가하여 세포를 고정합니다. 플레이트를 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- PFA를 흡인하고 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수 500μl를 천천히 첨가합니다(D-PBS, Ca2+ 및 Mg2+) 세포를 씻기 위해 우물 측면으로. 총 두 번 더 세탁을 반복합니다. 최종 세척을 흡인하지 마십시오.
- 플레이트를 파라필름으로 감싸고 나중에 처리하기 위해 4°C에서 보관하거나 다음 단계로 바로 진행합니다. 접시는 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.
3. Myelin Basic Protein의 면역세포화학 및 정량화
참고: 24웰 플레이트에서 액체 취급 절차를 수행할 때 셀이 건조되지 않도록 빠르게 작업하는 것이 좋습니다. 여기에서는 다중 채널 진공 흡입기와 다중 채널 피펫의 사용을 권장합니다.
- 플레이트를 실온으로 가져오고 우물을 흡인하고 250μl의 D-PBS를 추가합니다(ca2 + and Mg2+) 0.1% Triton X-100 및 5% normal goat serum (NGS)을 함유하고 있습니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 궤도를 흔들어 배양합니다.
- 마우스 단클론 항 MBP 항체 1:1,000 및 토끼 다클론 항 액틴 항체 1:200을 D-PBS에 희석하여 1차 배양 용액을 준비합니다(ca2+ and Mg2+) 5% NGS를 포함합니다. 대안적으로, 1:1,000의 토끼 다클론 항-Olig2는 혼합 신경교세포에서 희소돌기아교세포 특이적 정상화에 사용할 수 있습니다. 웰당 250μl를 수용할 수 있는 충분한 1차 용액을 준비합니다.
- 4°C에서 하룻밤 동안 16-18시간 동안 부드러운 안와 쉐이킹으로 1차 항체를 배양합니다.
- 1 차 배양 용액을 흡입하고 500 μl의 D-PBS로 세포를 3 x 10 분 세척합니다 (Ca2 + 및 Mg2+) 실온에서 부드러운 궤도 흔들림으로.
- 플레이트를 세척하는 동안 D-PBS에서 anti-mouse 680 및 anti-rabbit 800 항체를 1:500으로 희석하여 2차 배양 용액을 준비합니다(ca2+ and Mg2+) 5% NGS를 포함합니다. 이 솔루션을 준비할 때 주변광 노출을 최소화하십시오.
- 최종 세척을 흡인하고 250μl의 2차 배양 용액을 추가합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하고 부드러운 궤도 흔들림으로 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
- 2차 배양 용액을 흡입하고 500μl의 D-PBS로 웰을 3 x 10분 세척합니다(Ca2+ 및 Mg2+) 실온에서 부드러운 궤도 흔들림으로.
- 700nm 및 800nm 형광 방출을 감지할 수 있는 이미징 시스템을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 시작점으로 초점 오프셋을 3으로, MBP의 경우 감도를 1.5, Actin의 경우 5.0, Olig2의 경우 3.5로 설정합니다. 신호 과다 노출을 방지하기 위해 필요에 따라 감도 값을 조정합니다.
- 반자동 소프트웨어 기반 방법을 사용하여 희소돌기아교 형성 정도를 정량화합니다.
- 소프트웨어를 사용하여 플레이트 분석 모드를 "24 Well"로 설정하고 스캔된 웰의 바깥쪽 둘레를 중심으로 원을 정렬합니다. 정규화 채널을 "800"으로 설정하고 700nm(MBP) 및 800nm(Olig2/Actin) 채널에 대한 총 및 상대 형광 강도를 내보냅니다.
- 700nm에서의 강도를 800nm에서의 강도로 나누어 상대 형광 단위로 정규화된 MBP 발현을 제공합니다. 반복 실험 측정의 평균을 계산하고 분석에 필요한 대로 표현식을 Day 0 +PDGF 컨트롤로 스케일링합니다.
