Intraepidermal Nerve Fibers 내 미토콘드리아의 시각화

초록

출처: Hamid, H. S., et al. 인간 표피내 신경 섬유 내 미토콘드리아의 3차원 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 3차원 이미징을 사용하여 신경 특이적 미토콘드리아를 시각화하는 방법을 보여줍니다. 사전 라벨링된 표피내 신경 섬유의 순차적 스캔을 획득하고 3D 표면 이미지를 생성하여 신경 구조와 관련된 미토콘드리아를 분리하고 표시하는 프로세스를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

검체 채취와 관련된 모든 절차는 연구소의 IRB 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 컨포칼 이미징

1. 컨포칼 이미징 수행:
   1. 도립 현미경에서 40X 오일 침지(1.25 개구수(N.A.)) 대물렌즈가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 수집합니다.
      1. 각 초점면에서 형광 신호를 순차적으로 획득합니다.
         핵: 여기 λ = 405 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 420 - 480 nm
         신경 섬유: 여기 λ= 488 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ = 505 - 560 nm
         미토콘드리아: 여기 λ = 543 nm, 스펙트럼 방출 필터 λ= 606 - 670 nm
   2. 현미경 소프트웨어에 다음 스캔 매개변수를 입력합니다: 2 프레임 평균과 2.2의 줌으로 600Hz의 스캔 속도; 12비트 강도 해상도(4096 그레이 레벨).
      1. 최적화된 측면 해상도(스캔 해상도 = 1,024 x 1,024) 및 축 해상도/광학 절편(컨포칼 조리개 = 210nm의 z-스텝 크기에서 1 공기 단위(AU))을 위해 현미경 소프트웨어를 설정합니다. 위치
         참고: 결과 XYZ 해상도는 172.2 nm x 172.2 nm x 210 nm이고 이미지 크기는 176.1 μm x 176.1 μm x 30-50 μm입니다.
   3. 신경 신호(녹색 형광)에 대한 실시간 스캔을 활성화하고 Z-Focus Control을 사용하여 조직 섹션 내의 신경 신호를 포함하는 현미경 소프트웨어에서 상단 및 하단 초점면을 찾고 설정합니다. 총 z 범위는 일반적으로 50μm 조직 단면의 경우 30-50μm입니다.
   4. 라이브 스캔 중에 현미경 소프트웨어로 스캔 필드를 회전하여 표피가 이미지에서 수평 또는 수직으로 위치하도록 합니다.
   5. 각 신호를 개별적으로 스캔하고 검출기(광전자 증배관, PMT) 전압 및 오프셋을 조정하여 과포화 및 과소 포화 픽셀을 최소화/제거합니다.
      참고: 위의 매개변수를 사용한 스캔 시간은 z-슬라이스 수에 따라 약 20 - 40분이 소요됩니다.

2. 3D 인간 표피내 신경 섬유 내 미토콘드리아의 시각화 및 분석

1. 3D 표피 분리:
   1. 원본 이미지를 복제하고 이미지의 최대 강도 투영(확장 초점 보기)을 사용하여 표피를 식별하고 분리합니다.
   2. 관심 영역 도구를 사용하여 표피의 위쪽 및 아래쪽 가장자리를 따라 추적하여 표피내 신경 섬유가 없는 각질층 및 진피와 같은 원치 않는 영역을 제거합니다. 이 선택 영역으로 자릅니다.
2. 신경 및 미토콘드리아 형광 신호에 디콘볼루션 사용:
   참고: 디콘볼루션은 형광 신호의 무결성을 복원하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜에 사용된 복원은 이미지의 형광 신호를 사용하여 신호가 원래 소스에서 얼마나 확산되는지(점 확산 함수)를 결정하기 때문에 블라인드 디콘볼루션이라고 합니다. 이 프로세스는 신호 확산을 원래 위치로 다시 할당하여 신호 해상도를 개선합니다.
   1. 다음 매개변수를 사용하여 녹색 형광 신경 신호(녹색 형광)에 대한 점 확산 함수(PSF)를 계산합니다.
      1. 계산된 PSF를 컨포칼로 설정합니다. 중간 굴절률을 1.515로, 개구수를 1.25로 설정합니다. 검출기 핀홀을 1AU로 설정합니다. 레이저 여기 파장을 488nm로 설정하고 방출 파장을 515nm로 설정합니다.
   2. 다음 매개변수를 사용하여 적색 형광 미토콘드리아 신호(적색 형광)에 대한 PSF를 계산합니다.
      1. 계산된 PSF를 컨포칼로 설정합니다. 중간 굴절률을 1.515로, 개구수를 1.25로 설정합니다. 검출기 핀홀을 1AU로 설정합니다. 레이저 여기 파장을 543nm로 설정하고 방출 파장을 617nm로 설정합니다.
   3. 위에 나열된 해당 PSF와 100% 신뢰도로 설정된 반복 복원 기능과 10주기의 반복 제한을 사용하여 디콘볼루션을 통해 신경 및 미토콘드리아 형광 신호를 최적화합니다.
3. 신경 특이적 표면 생성:
   1. "표면 생성" 도구를 사용하여 단백질 유전자 생성물 9.5(PGP9.5)로 식별된 신경의 디컨볼루션된 녹색-형광 2차 표지로부터 신경의 단단한 표면을 만듭니다.
   2. "부드러운" 기능을 선택 취소하고 절대 강도 기능을 사용하여 배경 형광보다 훨씬 더 밝은 신경 신호의 임계값을 설정합니다.
   3. 절대 강도 기능을 사용하여 배경 형광보다 훨씬 더 밝은 신경 신호에 대한 임계값을 설정합니다. 신경을 정확하게 식별할 수 있을 만큼 임계값을 낮게 설정합니다.
   4. 크기에 따라 작고 신경이 없는 표면을 걸러냅니다.
      참고: 필요한 경우 CONTROL 키를 누른 상태에서 여러 개체를 강조 표시한 다음 Delete 키로 삭제하여 "편집" 탭에서 추가 비신경 표면을 수동으로 편집합니다.
4. 신경 특이적 형광 미토콘드리아 신호 분리:
   1. 신경 표면의 편집 탭을 선택하여 "마스크 속성" 기능을 확인합니다. 생성된 신경 표면은 각질세포와 관련된 미토콘드리아 신호로부터 해당 신경 내의 미토콘드리아를 분리하는 데 사용됩니다.
   2. "마스크 모두" 버튼이 "마스크 채널" 창을 열면 "채널 선택" 아래의 풀다운 메뉴에서 미토콘드리아 신호에 대한 디컨볼루션된 적색 형광 신호를 선택합니다.
   3. 상자를 클릭하여 "마스크를 적용하기 전에 채널 복제" 옵션에 확인 표시를 합니다.
   4. 마스크 설정의 "일정한 내부/외부" 옵션 앞에 있는 라디오 버튼을 클릭하고 상자를 클릭하여 "복셀 외부 표면 설정" 옵션에 체크 표시를 하고 값으로 0.00을 입력합니다. 확인 버튼을 클릭하여 신경 표면 내에서 미토콘드리아 신호를 나타내는 새 채널을 만듭니다.
5. 미토콘드리아 특정 표면 생성:
   1. "표면 생성" 도구를 사용하여 신경 특정 미토콘드리아 신호의 새로 생성된 형광 채널에서 미토콘드리아의 단단한 표면을 만듭니다.
   2. "부드럽게" 기능을 선택 취소하고 "배경 빼기" 기능을 선택하여 임계값을 설정합니다. 이 기능은 미토콘드리아 신호 주변의 국소 대비를 사용하여 배경에서 미토콘드리아를 식별합니다.
   3. 미토콘드리아를 정확하게 식별할 수 있을 만큼 임계값을 낮게 설정합니다. 이 예제에서 하한 임계값은 16비트(65,536) 스케일에 대해 2,000으로 설정되었습니다.
   4. 크기를 기준으로 미토콘드리아 표면을 필터링합니다. 이 예에서는 복셀 제한이 가능한 가장 낮은 제한인 1.0 복셀로 설정되었습니다. 필요한 경우 "편집" 탭에서 CONTROL 키를 누른 상태에서 여러 개체를 선택한 다음 Delete 키로 삭제하여 미토콘드리아 표면이 아닌 표면을 수동으로 편집합니다. 위치
      참고: 때때로 소프트웨어는 구별 가능한 형광 미토콘드리아 신호와 연결되지 않은 표면을 생성합니다. 이 경우 "편집" 탭에서 제거할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
라이카 SP5 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	라이카 마이크로시스템즈, 일리노이주 버팔로 그로브	SP5
Volocity x64 소프트웨어	Perkin Elmer, Waltham, MA	버전 4.4.0	Volocity 소프트웨어는 이미지 처리에 사용됩니다.
Imaris x64 3D 분석 소프트웨어{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	버전 7.7.1	Imaris 소프트웨어는 이미지 분석에 사용됩니다.