뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

초록

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018)

이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

프로토콜

1. 애벌레 뇌 이식의 준비

1. 이미징 챔버를 만듭니다.
   참고: 안정적인 기록을 위해서는 뇌 이식이 묶여 있어야 합니다. 여기서, 저가의 수제 이미징 챔버는 Ca²⁺ 이미징 시스템입니다.
   1. 집게를 사용하여 플라스틱 배양 접시의 하단 중앙(35mm x 10mm)을 긁어 유충 뇌의 복부 신경절에 움푹 들어간 곳을 만들어 장착을 더 쉽게 만듭니다(1.3단계, 그림 1).
   2. 이쑤시개로 움푹 들어간 곳의 양쪽에 작은 초강력 접착제를 떨어뜨리고 접착제에 텅스텐 막대(직경 0.125mm, 길이 6-7mm)를 부착합니다.
   3. 퍼티와 같은 재사용 가능한 작은 접착제 조각을 사용하여 움푹 들어간 곳을 둘러싼 원형 벽(직경 10mm, 높이 3mm)을 만듭니다(그림 1)을 참조하십시오.
      참고: 벽 내부 공간은 나중에 인산염 완충 식염수(PBS, 0.14M 염화나트륨(NaCl), 0.0027M 염화칼륨(KCl), 0.01M 인산염 이온(PO4^3–), pH 7.4 ± 25°C에서 0.05).
2. 동물 준비
   참고: 칼슘 이미징의 경우, 칼슘 지표인 GCaMP6s는 관심 세포 유형으로 표현되며, 이는 일반적으로 조직 특이적 GAL4 및 UAS-GCaMP6s. 신호가 후보 수용체를 통해 매개되도록 하기 위해 GCaMP6s는 수용체의 돌연변이 결함에서도 발현됩니다.
   1. 야생형 및 돌연변이와 같은 다른 유전자형에 대한 실험적 비교가 필요한 경우, 발달 단계로 인한 GCaMP6 발현 수준 변화 및 생리학적 차이를 피하기 위해 유충의 연령 일치 테스트.
   2. 표준 파리 먹이가 들어 있는 배양 바이알에 어미 파리(성별당 30마리)를 8시간 동안 보관하여 음식 표면에 알을 낳을 수 있도록 합니다. 배양 유충은 25 ° C 및 60-70 % 상대 습도에서 12 시간 명암 주기에서 대량

으로 발생합니다.

3. 유충 뇌 해부
   1. 알을 낳은 후(AEL) 90-120h에 유충을 모아 증류수로 최소 3회 씻어 부착된 음식물 찌꺼기를 제거합니다.
   2. 얼음처럼 차가운 PBS로 채워진 정사각형 1.5인치 시계 유리에 애벌레를 놓습니다.
      참고: 다음 두 단계는 해부 현미경 아래의 이 시계 유리에서 수행됩니다.
   3. 집게를 사용하여 유충의 중간 부분을 부드럽게 잡습니다. 다른 집게를 사용하여 입 고리를 잡고 입 고리를 부드럽게 당겨 뇌를 포함하는 유충의 앞쪽 부분을 신체의 나머지 부분과 분리합니다.
      참고: 양자택일로, 수술용 가위를 사용할 수 있습니다.
   4. 집게로 앞쪽 끝을 잡고 유충을 뒤집습니다. 뇌에 붙어 있는 상상의 디스크, 지방체, 고리샘과 같은 외부 조직을 제거합니다. 뇌와 입 부분을 부드럽게 분리합니다.
   5. 이미징 챔버에서 퍼티와 같은 재사용 가능한 접착제로 만든 링 내부에 200μL의 PBS를 적용합니다. PBS로 절개된 뇌를 파스퇴르 피펫으로 부드럽게 빨아들인 다음 이미징 챔버로 옮깁니다.

4. 뇌를 이미징 챔버로 설정
   1. 집게를 사용하여 배신경절에서 뻗어 있는 근육 섬유를 잡습니다. 텅스텐 와이어 아래의 움푹 들어간 곳에 뇌를 부드럽게 삽입합니다.
   2. 다른 집게를 사용하여 텅스텐 와이어를 약간 위로 당겨 뇌를 이미징을 위한 올바른 위치에 배치합니다(그림 1).

2. Ca 인수²⁺ 형광 이미지

참고: PBS에 잠긴 뇌 외설물은 20X 수침 대물 렌즈(개구수, N.A. = 0.5)가 장착된 형광 현미경을 사용하여 이미지화됩니다. PBS는 뇌의 세포를 활성화하지 않습니다. Z축 이미지가 필요한 경우 대물 렌즈에는 압전 활성화 렌즈 무버가 장착됩니다. 회전 디스크 컨포칼 헤드는 시간 해상도를 향상시키는 데 사용됩니다. 저조도 이미징을 위해 전자 증식 전하 결합 장치 카메라가 현미경에 장착됩니다. GCaMP6s 형광(여기/방출: 488/509 nm)의 이미징에는 이색성 빔 스플리터와 방출 필터(e.., 528 ± 38nm 대역 통과 필터).

1. 뇌 이식이 들어있는 이미징 챔버를 현미경 아래에 놓습니다.
2. PBS에 닿을 때까지 대물렌즈를 내립니다. 명시야 조명 아래에서 뇌를 배치하고 초점을 맞춥니다. 형광등으로 전환하고 GCaMP6s 표지 세포의 초점을 조정합니다.
   참고: 기본 녹색 GCaMP6의 형광이 보여야 합니다.
3. 적절한 수집 소프트웨어를 사용하여 수냉식 모드에서 512 × 512 픽셀의 해상도에서 250ms/프레임으로 획득을 시작하십시오(e.g., μManager)를 참조하십시오. CCD(charge-coupled device) 카메라의 다이내믹 레인지 내에서 16비트 이미지(다이나믹 레인지 0-65,535)와 함께 1000(임의 단위) 이상의 형광 값을 얻으려면 노출 시간을 조정합니다.
   참고: GCaMP6의 광표백을 최소화하기 위해 낮은 노출 시간을 사용해야 합니다. 노출 시간은 GCaMP6의 발현 수준과 검출 시스템의 감도에 따라 달라지므로 각 실험에서 최적화해야 합니다. dilp2>GCaMP6s를 사용한 >실험에서 100ms였습니다. 주어진 이미징 깊이에 대해 z-섹션이 필요한 경우 노출 시간 및 프레임 간격에 따라 여러 z-섹션 이미지를 획득할 수 있습니다. 카메라의 공간 해상도가 충분하면 노출 시간을 줄이기 위해 비닝 크기(하나의 디지털 픽셀로 비닝될 칩의 레지스터 수)를 늘려야 합니다.
4. 이미징 매개변수가 결정되면 기준선 신호 강도를 감지하기 위해 펩타이드 투여 전 1분 동안 이미지를 촬영합니다(F₀).
5. 시험 펩티드를 적용하십시오. 이를 위해 PBS에 100μL의 펩타이드 용액을 용해시키고 유충 수조에 직접 피펫팅하여 최적의 농도를 산출합니다.
   NOTE: 펩타이드 용액은 천천히 주입해야 합니다(e., 유속 20 μL/s)를 피펫을 사용하여 수조 용액에 넣습니다. PBS에 용해된 관련 없는 합성 펩타이드가 음성 대조군으로 사용됩니다.
6. 몇 분 동안 GCaMP6s 방출을 기록합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
텅스텐 막대	A-M systems, Sequim, WA, USA	717000	<
블루 압정	Bostik, Paris, France	3049100	퍼티와 같은 재사용 가능한 접착제
시계 유리, 정사각형, 1 5/8 in	Carolina Biological Supply Company, 미국 노스캐롤라이나주 벌링턴	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	T900	인산염 완충염
CCHa2	SCRUM Inc., Tokyo, Japan
Ghrerin	펩타이드 연구소 Inc., 오사카, 일본	4372-s
Nociceptin	펩타이드 연구소 Inc., 오사카, 일본	4313-v
Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	Axio Imager A2	형광 현미경
Objective w N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	420957-9900-000	Water-immersion objective lens
긴 이동 범위를 가진 P-725 PIFOC 대물 스캐너	N/A	압전 활성화 렌즈 발동기
컨포칼 스캐너 유닛 CSU-W1	일본 도쿄 요코가와 전기 <	회전 디스크 컨포칼 헤드
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD 카메라
OBIS 488 nm LS 60 mW	Coherent, Santa Clara, CA, USA	1178770	488-nm 레이저
488 / 568 / 647 nm 요코가와 이색성 빔 스플리터	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	이색성 빔 스플리터
528/38 nm BrightLine 단일 대역 통과 필터	Semrock, Rochester, NY, USA	FF01-528/38-25	방출 필터
μManager	N/A	https://micro-manager.org

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