Mouse Brain Section에서 Ependymal cell ciliary activity의 라이브 이미징

초록

출처: Al Omran, A. J., et al. 마우스 뇌의 외측 심실에 있는 뇌실막의 실시간 이미징. J. Vis. Exp. (2015).

이 비디오는 미분 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 시상 쥐 뇌 절편에서 뇌실막의 박동을 관찰하는 실시간 이미징 기술을 보여줍니다. 뇌실막(epiendymal cilia)은 뇌척수액(CSF)을 추진하며, 이들의 활동은 영양이 풍부한 배지로 유지되고 기후 조절실에서 영상화되는 뇌 절편에 기록됩니다. 고대비 비디오를 통해 기능적 섬모를 식별하고 박동 빈도를 정량화할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 뇌 추출, 절편 및 조직 준비

1. 야생형 마우스 균주 C57BL/6을 CO₂ 5분 동안 질식시켜 희생합니다. 경추 탈구로 인한 사망을 확신합니다.
2. 70% 에탄올로 마우스 머리를 청소합니다.
3. 멸균 가위와 집게를 사용하여 두개골 절제술을 시행하려면 먼저 머리 꼭대기부터 두개골을 노출시키기 위해 피부를 떼어냅니다.
4. 그런 다음 두개골이 노출되면 뒤쪽에서 시작하여 앞쪽으로 이동하면서 뼈를 한 조각씩 벗겨 두개골을 제거합니다. 뇌실을 파괴하지 않도록 주의한다.
5. 전체 뇌를 수집합니다.
6. 100 mm 페트리 접시에 둘베코의 변형 독수리 매체(DMEM)/고포도당에 10% 소 태아 혈청(FBS)과 10,000 units/ml의 페니실린과 10,000 μg/ml의 스트렙토마이신이 함유된 10,000 μg/ml의 스트렙토마이신이 들어 있는 100mm 페트리 접시에 넣고 37°C로 예열합니다.
7. 중간 시상면에서 뇌를 손으로 자릅니다. 날카로운 칼날을 사용하고 비브라톰을 사용하여 각 절반에서 처음 100-200mm 단면을 얻습니다.
위치
8. 예열된 37°C 인산염 완충 식염수(1x PBS) 용액으로 뇌 조직을 헹굽니다.
9. 즉시 37°C로 예열된 DMEM/고혈당 매체에 뇌 절편을 놓습니다.

2. 라이브 이미징 구성 및 설정

1. {{}}DMEM/고혈당 배지 1ml가 들어 있는 30mm 유리 바닥 배양 접시에 뇌 조직 절편을 놓습니다. 현미경의 밀폐된 챔버 환경을 37°C, 95%/5% O₂/CO₂ 함량(그림 1)으로 조정합니다.
2. 60X 대물렌즈 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 60X 대물렌즈에 오일 방울을 놓고 일반 미분 간섭 대비(DIC) 투과광이 있는 세포에 초점을 맞춰 뇌실막세포/섬모 이미지를 수집합니다.
3. 그런 다음, DMEM 거품 움직임의 방향을 따라가면 섬모 박동이 해당 지역에서 일종의 거품 움직임을 생성함에 따라 운동성 뇌실막섬모의 위치에 대한 안내를 받습니다. DIC 필터를 사용하여 뇌의 외측심실에 운동성 섬모가 있는 건강한 세포가 있는 영역을 선택합니다. ependymal 섬모가 발견되면 만족스러운 이미지를 얻기 위해 빛과 초점을 조정합니다.
4. Metamorph 이미징 소프트웨어를 사용하여 특정 목적에 따라 라이브 이미징 매개변수를 설정합니다. 본 데모에서는 카메라 비닝을 1 x 1로 설정하고 60X 대물렌즈 및 5-10msec 노출 시간과 결합하여 24비트 이미지를 획득합니다.
5. 최소 노출 시간을 위해 현미경 조리개를 최적의 수준으로 열어 DIC 이미지를 수집합니다. 카메라로 스트리밍되는 실시간 이미지를 관찰하여 지연 없이 빠르고 즉각적인 이미지 획득을 제공합니다. 충분한 이미지 대비를 얻기 위해 최소 노출 시간의 요구 사항에 따라 섬모 박동 속도를 계산합니다.

결과

재료