Imaging of Neuronal Mitochondria Using a Serial Block-Face Scanning Electron Microscope(직렬 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 신경 미토콘드리아의 이미징)

초록

출처: Mukherjee, K., et. al. 연속 블록면 주사 전자 현미경을 사용한 뇌 미토콘드리아의 분석.J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 준비 과정을 보여줍니다. 미토콘드리아 초미세 구조를 시각화하기 위해 연속 블록 페이스 주사 전자 현미경(SBFSEM)을 사용하여 마우스 뇌 조직의 이미징 및 분석을 통해 축삭 및 수지상 신경 세포 구획의 형태 및 공간 분포를 정밀하게 매핑할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회.

1. 뇌 조직 및 SBFSEM 이미징의 준비

1. 기관 지침에 따라 4 - 5% 이소플루란을 사용하여 젊은(~2 - 4개월) C57 검은색 마우스(C57BL/6J 균주)를 마취합니다. 근육 긴장도의 손실, 자발적인 움직임의 부족, 꼬리 꼬집기와 같은 혐오스러운 자극에 대한 반응을 모니터링하여 마취를 확인합니다.
2. 해부 트레이에 마우스를 고정하고 복부 정중선을 따라 피부를 절개합니다. 마우스의 흉곽을 노출시키기 위해 피부를 더 절개합니다. 횡격막을 절개하고 주변을 따라 흉강을 조심스럽게 절개하여 박동하는 심장을 드러낸 다음 오른쪽 심방을 절개합니다.
3. 나비 캐뉼라를 사용하여 좌심실을 캐뉼러화합니다. 10 - 20 ml의 인산염 완충 식염수(PBS) pH 7.2를 사용하여 간 색의 변화로 피혈이 확인될 때까지 마우스를 경심으로 관류합니다.
   참고: 간 색의 변화는 출혈의 정도를 결정하기 위한 지침으로 사용됩니다. 간 색이 적갈색에서 옅은 분홍색으로 변하는 것을 확인합니다.
4. 0.10M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)에 만들어진 2% 글루타르알데히드와 4% 파라포름알데히드 10-20ml를 사용하여 쥐를 경심으로 관류하여 뇌 조직을 내부로부터 빠르게 고정합니다. 고정은 꼬리가 뻣뻣해지는 것을 관찰하여 모니터링됩니다.
   참고: 물 80ml에 카코딜산나트륨 2.14g을 녹여 0.10M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)을 준비하고 염산을 첨가하여 pH를 조정한 후 물로 100ml로 부피를 만든다.
5. 관류 후, 마우스의 목을 베고 뇌를 해부 한 다음 4 <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>^oC.
6. 48시간 후 비브라톰을 사용하여 400μm의 관상 절편을 만든 다음 해부 현미경으로 뇌의 관심 영역(예: 해마)을 조심스럽게 해부합니다. 티슈를 조심스럽게 다듬고 방향을 유지하기 위해 사진을 찍습니다.
   참고: SBFSEM에서 조직 염색의 후처리 방법은 해상도를 개선하기 위해 다양한 중금속 염색 방법을 결합합니다. <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>.
7. 글루타르알데히드 고정 조직을 0.1M 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
8. 0.1M 카코딜레이트 나트륨 완충액(pH 7.2)에 탄닌산을 용해시켜 0.1% 탄닌산 용액을 준비합니다. 용해될 때까지 소용돌이치고 필요한 경우 0.45μm 필터를 통해 필터링합니다.
9. RT에서 30-60분 동안 1ml 시약에서 배양하여 카코딜레이트 완충 0.1% 탄닌산으로 조직을 후수정하십시오.
   참고: 배양 시간은 조직 크기에 따라 다르지만 대부분의 조직에는 30분이 가장 적합합니다.
10. 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)에서 티슈를 각각 5분씩 3회 세척합니다.
11. 0.3 g 페로시안화 칼륨과 0.86 g 카코딜레이트 나트륨을 10 ml 증류 H에 용해₂O (dH₂O).페로시안화칼륨 용액을 얼음 위에 두십시오. 사용하기 직전에 4% 사산화오스뮴 10ml를 추가합니다(OsO₄).
12. 얼음 위에서 2% 오스뮴-페로시아나이드 용액으로 조직을 90분 동안 염색합니다. dH₂O.
13. 0.1g TCH를 10ml dH에 용해시켜 1% 티오카르보하이드라지드(TCH) 용액을 준비합니다₂O. 완전히 용해될 때까지 10분마다 소용돌이쳐 60°C에서 녹입니다. TCH를 취급하는 동안 안전 예방 조치를 준수하고, 특히 금속 사용, 고온으로 가열하거나 용액이 건조되지 않도록 주의하십시오.
14. RT에서 20분 동안 갓 준비한 1% TCH로 샘플을 처리합니다. dH₂O.
15. 4 % 희석 OsO₄ dH로 2 %까지₂O, 1시간 동안 배양하여 2% 사산화오스뮴 수용액으로 조직을 염색합니다. 티슈 3회, 각 5분, dH₂O.
16. dH24 °C에서 O.
17. Walton의 리드 아스파르테이트 솔루션을 준비합니다.
    1. 250 ml dH₂O를 추가한 다음 pH가 5.5에 도달할 때까지 10N 수산화칼륨(KOH)을 적음으로 추가합니다. pH 조정 후 아스파르트산 스톡 10ml에 질산납 0.066g을 넣고 60°C에서 30분 동안 가열합니다.
18. dH₂O를 선택하고 60°C 오븐에서 30분 동안 Walton의 리드 아스파르테이트 염색으로 배양합니다. dH₂O.
19. 20%, 50%, 75%, 85%, 95% 에탄올의 냉각 용액을 사용하여 등급별 알코올 시리즈를 통해 샘플을 탈수한 다음 100% 에탄올을 각각 10분씩 3회 탈수합니다.
    참고: 개봉한 에탄올은 공기의 물을 흡수하여 매립에 실패하므로 갓 개봉한 병의 100% 에탄올을 사용하십시오. 더 큰 조직 샘플의 경우 더 긴 배양이 필요합니다.
20. 프로필렌 옥사이드에서 샘플을 각각 15분씩 2회 세척합니다.
21. 25ml 수지, 10.5ml DDSA(도데세닐 숙신산 무수물), 15.5ml NMA(나딕 메틸 무수물) 및 1ml DMP-30(2,4,6-Tris dimethylaminomethyl phenol)을 사용하여 플라스틱 매립 수지를 만듭니다. 흔들어 수지를 섞습니다. 회전하고 거품이 해결될 때까지 수지를 그대로 두십시오.
    참고: 이것은 표준 중간 경도 레시피입니다. 다른 유형의 전자 현미경(EM) 플라스틱 수지를 사용할 수 있지만 모든 수지가 SBFSEM에서 작동하는 것은 아니므로 사전에 필수적이지 않은 대조군 샘플로 테스트해야 합니다.
22. 임베딩 수지와 프로필렌 옥사이드를 50:50 비율로 혼합한 바이알에 O/N을 배양하여 처음에는 뚜껑을 닫고 2시간 후에 뚜껑을 열어 프로필렌 옥사이드가 약 8-10시간 동안 증발하도록 합니다.
23. 깨끗한 바이알에 티슈를 100% 새로 포매한 수지로 2시간 동안 옮깁니다.
24. 인쇄된 종이 라벨이 들어 있는 평평한 틀에 새 임베딩 레진에 샘플을 삽입하고 60°C의 오븐에서 48시간 동안 경화시킵니다. 약 1시간 후 조직 배치 및 정렬을 다시 확인하고 필요한 경우 조정합니다.
25. 샘플을 관심 영역으로 자르고 겔화 시아노아크릴레이트 초강력 접착제 또는 전도성 에폭시 수지를 사용하여 알루미늄 핀에 장착합니다. 그런 다음 블록의 측면을 콜로이드 실버 페이스트로 코팅하여 알루미늄 핀에 대한 전도성 경로를 제공합니다.
26. 챔버 내 초박 절편기 스테이지와 낮은 kV 후방 산란 전자 검출기가 장착된 주사 전자 현미경 시스템을 사용하여 조직 표본을 검사합니다.
    참고: 주사전자현미경(SEM) 사용에 대한 기기 및 현장 교육을 받고 승인된 사용자가 됩니다. 또는 소규모 프로젝트를 위해 연구원 또는 핵심 시설과의 협업이 가능할 수 있습니다. SEM이 X선을 생성하므로 방사선 교육이 필요할 수도 있습니다.
27. 샘플을 이미지화하려면 2.25 kV, 5 - 10 nm/픽셀 해상도, x,y에서 80 - 250 μm(다른 필드 크기 가능)의 필드 크기, 50 - 100 nm의 슬라이스 두께, 16 - 20시간 동안 총 250 - 600 슬라이스 설정을 사용하십시오.
    참고: 설정은 현미경, 개별 샘플 및 원하는 해상도에 따라 크게 다릅니다. 이러한 설정은 많은 샘플에 대해 쉽게 해석할 수 있는 이미지를 생성해야 합니다.

2. 이미징 데이터셋 분석

참고: Image J/Fiji 소프트웨어는 데이터 세트를 분석하는 데 사용되며 TrakEM2 플러그인에 의존합니다. 전처리 단계는 다양한 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있으며 경험 수준과 얻은 스택에 따라 광범위하거나 작을 수 있습니다. 오픈 소스 소프트웨어(ImageJ ver 1.50b, FIJI 다운로드 2015년 10월 1일)를 사용한 주요 변환은 여기에 설명되어 있습니다.

1. 소프트웨어를 열고 Image→Type→8 bit 메뉴 항목을 선택하여 원본 독점 16비트 이미지에서 이미지를 8비트 tiff 형식으로 변환합니다.
   1. 이 단계에서 자동 대비/밝기 변환이 이미지에 적합하지 않은 경우 16비트 이미지를 다시 열고 Image→Adjust→Brightness/Contrast를 누릅니다. 모든 이미지에 사용할 수 있는 범위를 선택하고 적용을 누릅니다. 그런 다음 변환을 수행합니다. 참고: 일부 SEM에서는 이 단계에 현미경이 필요할 수 있습니다. 제조업체 소프트웨어.
   2. 필요한 경우 슬라이스 간의 허용되지 않는 이미지 이동으로 인해 (e. 충전으로 인한 드리프트), 이미지 스택을 등록/정렬합니다(메뉴 항목 Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). 대부분의 등록 소프트웨어에서는 "rigid body"가 아닌 "translation-only" 모드로 설정됩니다.
      참고: 많은 접근 방식과 소프트웨어가 작동할 수 있습니다: SIFT 등록 플러그인은 많은 응용 프로그램에서 작동하며 가상 스택 버전이 있습니다.
      1. 필요한 경우 등록하기 전에 캔버스 크기를 확대하거나(Image→Adjust→CanvasSize) 관심 영역(Image→Crop)으로 줄입니다.
         참고: 약간의 드리프트 또는 스플레이가 발생할 수 있으며 다른 플러그인이나 소프트웨어를 시도하면 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다. 수동 옵션도 사용할 수 있습니다 (e.g. ImageJ/FIJI, Plugins→Registration→ManualLandmarkSelection)을 사용합니다.
   3. 원하는 경우 ImageJ (Image→Scale)를 사용하여 이미지를 더 작고 관리하기 쉬운 크기(e.. 25%) ImageJ (ImageScale 사용))을 사용합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6J mice	Jackson laboratory	664
Isoflurane	VETone, 상품명 Fluriso	501017
Dissection tray	피셔 사이언티픽	S65105
해부 가위	Ted Pella Inc.	1316
Butterfly canula	Exel International	26704
인산염 버퍼 식염수	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
Filter(0.45 미크론)	EMD Millipore	NC0813356
해부 현미경	Olympus	SZ61
진동 단면 시스템	Ted Pella Inc.	Vibratome 3000
Sodium Cacodylate	EMS	12300
Tannic Acid	EMS	21700
페로시안화칼륨	J.T. Baker	14459-95-1	<
Osmium Tetroxide 4% 용액	EMS	19150
Thiocarbohydrazide	EMS	21900
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich
수산화칼륨	Acros Organics	43731000	<
납 질산염	EMS	17900
EMbed-812 임베딩 키트	EMS	14120	Embed 812 resin, DDSA, NMA 및 DMP-30을 포함합니다.
글루타르알데히드 25% EM Grade	주식회사 폴리사이언스	1909
Paraformaldehyde	EMS	19202
Uranyl Acetate	EMS	22400
Ethanol	EMS	15055
프로필렌 옥사이드	EMS	20400
Embedding Mold	EMS	70907
알루미늄 시편 핀	EMS	70446
콜로이드 실버 액체	EMS	12630
Razor	EMS	72000
Super Glue (록타이트 젤 컨트롤)	Loctite	234790
전도성 에폭시	Ted Pella Inc.	16043
주사 전자 현미경	Zeiss	시그마 VP
SEM<	3View2	수 있습니다. 다른 SEM을 위해 설계되었습니다
핀 준비를 위한 트리밍 현미경	주식회사 가탄	3View 시스템의 일부로 제공됨
Low kV backscattered electron detector	주식회사 가탄	3V-BSED
ImageJ/ 피지 처리 패키지	ImageJ ver 1.50b, FIJI download 2015년 10월 1		http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
			http://rsb.info.nih.gov/ij/
			http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf<
			http://fiji.sc/TrakEM2

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