Identification of Mouse Retinal Ganglion cell subtypes via fluorescent tracing (형광 추적을 통한 마우스 망막 신경절 세포 아형의 식별)

초록

출처: Laboissonniere, et. al입니다. 망막 신경절 세포의 정의된 부분 집합의 단일 세포 RNA-seq. J. Vis. Exp. (2017).

이 비디오는 형질전환 마우스 망막에서 망막 신경절 세포(RGC) 아형을 식별하는 형광 추적 기술을 보여줍니다. 이 프로세스에는 기록 챔버에 분리된 망막을 고정하고, 산소 관류로 세포 생존력을 유지하고, 추적자가 있는 피펫을 사용하여 형광 표지된 망막 신경절 세포를 표적으로 하는 것이 포함됩니다. 이 방법은 수지상 형태 및 성층화를 분석함으로써 별개의 망막 신경절 세포 아형을 분류할 수 있습니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토에 의해 검토되고 승인되었습니다..

1. 망막 조직의 준비 (2 h)

참고: 이 섹션의 모든 절차는 희미한 빨간색 조명 아래에서 수행해야 합니다.

1. 해부 전 최소 1시간 동안 동물을 어둡게 적응시킵니다. 희미한 빨간색 조명 아래에서 모든 절차를 수행합니다.
2. CO₂ 질식시키고 안구를 이전에 산소가 공급된 세포외 용액이 있는 페트리 접시로 적혈화합니다.
3. 각막을 바늘로 찔러 안과 가위로 각막과 공막의 경계를 잘라냅니다.
4. #5 집게를 사용하여 렌즈를 제거합니다. 겸자로 공막을 부드럽게 찢고 망막과 공막이 만나는 시신경을 절단합니다. 망막에서 공막을 조심스럽게 제거합니다.
5. # 5 집게를 사용하여 투명한 유리체를 제거하십시오. 일단 제거되면 유리체는 겸자에 붙어있는 젤라틴 같은 물질로 나타납니다. 망막을 반으로 자르고(4개/동물이 있도록) 사용할 때까지 산소가 공급된 세포외 용액에 RT로 보관합니다.
6. 기록 챔버에 조직을 장착할 준비가 되면 500μL의 산소가 공급된 세포외 용액에 희석된 효소 용액에 망막 조각을 넣어 배양합니다. 페트리 접시에 넣고 셰이커에 올려 실온(RT)에서 2분간 배양합니다.
   1. 산소가 공급된 세포외 용액으로 망막 조각을 씻고 조직을 유리 바닥 기록 챔버에 넣으십시오. 조직에 손상을 주지 않고 망막이 전달될 수 있도록 끝이 잘린 플라스틱 전사 피펫을 사용하십시오.
7. 집게를 사용하여 광수용체층이 아래를 향하도록 조직을 조심스럽게 평평하게 만듭니다. 피펫을 사용하여 과도한 액체를 제거하십시오. 나일론 메쉬가 있는 백금 링을 사용하여 조직을 고정합니다.
   참고: 이 방법은 표지된 무축삭 및 양극성 세포에서 RNA를 분리하기 위해 조직을 준비하는 데에도 사용할 수 있습니다.
8. 산소가 공급된 세포외 용액으로 챔버를 채우고 현미경 스테이지에 장착합니다. 산소가 공급된 세포외 용액으로 조직을 2-4mL/분으로 관류합니다.

3. GFP+ 망막 신경절 세포의 시각화 및 타겟팅 (10분)

참고: 이 섹션의 모든 절차는 희미한 빨간색 조명에서 수행해야 합니다

2. IR-DIC(Infrared Differential Interference Contrast) 광학 장치(그림 1A). epifluorescence (~480 nm)를 사용하여 녹색 형광 단백질(GFP) + 망막 신경절 세포(RGC) 식별(그림 1B).
3. DIC에서 세포 내 용액으로 채워진 피펫을 찾습니다. 약간의 양압과 0 볼륨을 적용하십시오.tage 오프셋 amp리퍼.
4. 유리 마이크로피펫을 GFP+ 세포에 대고 누르고 음압을 가하여 피펫과 세포막 사이에 GΩ 밀봉을 형성합니다. 테스트 전압 명령 단계 적용 (e., 5mV)를 사용하여 밀봉 저항을 모니터링합니다. 안정적인 밀봉을 형성한 후 짧은 음압 펄스를 가하여 멤브레인을 파열하여 전체 세포에 접근할 수 있도록 합니다.
5. 세포의 수상돌기가 형광 추적기로 채워질 때까지 1-2분 정도 기다립니다.
   참고: 세포는 형광에서 형태학을 검사하여 형태학적으로 유형화할 수 있습니다(그림 1C). 멜라놉신 발현 망막 신경절 세포의 경우, 에피형광 조명 하에서 형광 추적자로 채워진 수상돌기를 검사하고 OFF 아층의 소마에서 멀리 떨어진 곳(M1 ipRGCs), ON 아층판의 신경절 세포층 근처(M2 & M4 ipRGCs) 또는 둘 다(M3 ipRGCs)를 측정하여 내부 망상층의 수상돌기 층화를 시각화합니다. 이 관찰은 소마 크기(M4는 다른 모든 ipRGC 아형에 비해 뚜렷하게 큰 소마를 가지고 있음)와 결합되어 세포 유형을 식별할 수 있습니다. 따라서 이 기술을 사용하면 셀 유형을 식별할 수 있습니다 in vitro RNA 분리 전. 이 방법은 수지상 형태학 또는 세포 생리학을 포함하는 다른 세포 유형 식별 프로토콜에 맞게 수정할 수 있습니다.

결과

그림 1: 멜라놉신 발현 ipRGC의 GFP 발현 및...

재료