Fluorescence Photoactivation Imaging of Neurofilament Transport in Myelinated Mouse Axons(수초화된 마우스 축삭돌기에서 신경필라멘트 수송의 형광 광활성화 이미징)

초록

출처: Boyer, N. P. et. al., 절제된 마우스 경골 신경에서 신경필라멘트 수송의 이미징 및 분석. J. Vis. Exp. (2020)

이 비디오는 분석을 위한 형광 광활성화 방법을 보여줍니다. 말초 신경의 수초화된 축삭돌기에서 neurofilament 수송. 광활성화 녹색 형광단이 부착된 신경필라멘트를 추적함으로써 이 기술은 신경퇴행성 질환의 축삭 수송에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 신경 식염수 준비

1. 브로이어 식염수 100mL 만들기: 98mM 염화나트륨(NaCl), 1mM 염화칼륨(KCl), 2mM 인산이수소칼륨(KH₂PO₄), 1 mM 황산 마그네슘 (MgSO₄), 1.5mM 염화칼슘(CaCl₂), 5.6% D-glucose, 23.8 mM sodium bi-carbonate (NaHCO₃) 이중 증류수.
2. 사용하기 전에 최소 30분 동안 식염수를 통해 95% 산소/5% 이산화탄소(발암물질)를 거품으로 만듭니다. 남은 식염수는 일주일 이내에 재사용할 수 있습니다. 그러나 매번 사용하기 전에 재산소화해야 합니다.
3. 산소가 함유된 식염수를 60mL 주사기에 붓고 주사기에 공기가 최소한으로 남아 있는지 확인합니다.

2. 신경 관류실의 초기 조립

1. span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>그림 1A, 유출 튜브를 폐기물 플라스크에 넣습니다.
2. 외부 개스킷을 관류 챔버 하우징에 놓고 흐름 입구 및 출구 기둥이 개스킷의 구멍과 정렬되었는지 확인합니다.
3. 내부 개스킷(실리콘, 100μm 두께)을 #1.5 원형 커버슬립(직경 40mm)에 놓고 개스킷의 주름을 조심스럽게 펴서 단단히 밀봉합니다. 나중에 쉽게 조립할 수 있도록 커버슬립과 개스킷을 종이 타월이나 작업용 물티슈에 개스킷이 위를 향하도록 놓습니다.

3. 쥐 경골 신경의 해부 및 준비

1. 이산화탄소 흡입 또는 다른 제도적으로 승인된 방법으로 동물을 희생시킵니다. 동물이 움직임/호흡을 멈출 때 타이머를 시작하며, 실험은 희생 후 3시간 이내에만 수행해야 합니다.
2. 털에 70% 에탄올을 뿌리고 전기 면도기를 사용하여 동물의 다리와 등에서 가능한 한 많이 제거합니다.
3. 한 쌍의 큰 해부 가위를 사용하여 척추 중앙 근처의 피부를 등쪽을 절개하고 동물의 복부 주위를 계속 자릅니다. 이 컷에서 시작하여 근육에서 부드럽게 당겨 근막을 잘라 다리의 피부를 천천히 반사시킵니다.
4. 동물을 누운 자세로 해부 트레이에 놓고 네 발을 모두 고정합니다. 선택적으로 꼬리를 고정하여 움직임을 더 줄입니다.
5. 현미해부 가위를 사용하여 꼬리와 무릎 중간의 허벅지 근육을 절개하여 좌골 신경을 노출시킵니다. 근육을 통해 볼 수 있는 신경이 절단되지 않도록 하십시오.
6. 절개 부위를 등쪽과 배쪽으로 늘려 근육을 제거합니다. 마찬가지로, 종아리의 근육을 제거하고 신경 손상을 방지하기 위해 상처를 얕고 짧게 유지하십시오.
7. 경골 신경이 좌골 신경(무릎)에서 발뒤꿈치까지 분기되는 지점에서 완전히 노출될 때까지 근육을 제거합니다(그림 2A)을 참조하십시오.
   참고: 경골 신경 박리를 포함한 모든 단계에서 경골 신경에서 광활성성 녹색 형광 단백질(paGFP)의 우발적인 활성화를 최소화하기 위해 주변광에 불필요하게 노출되지 않도록 합니다.
8. 한 쌍의 집게로 척추-근위 끝의 경골 신경을 잡고 한 쌍의 현저절부 가위를 사용하여 신경을 자릅니다. 신경에 긴장을 가하지 않도록 주의하고 근육에서 신경을 들어 올려 부착물을 잘라냅니다.
9. 경골 신경의 척추 말단 끝을 잘라내고 실온에서 산소가 공급된 식염수가 담긴 작은 페트리 접시로 옮깁니다. 절차의 이 시점부터는 항상 신경의 근위부 및 원위부 끝을 추적해야 합니다.
   참고: 그렇게 하는 한 가지 방법은 테이퍼가 보이도록 비스듬히 절개하여 신경의 말단
부를 표시하는 것입니다.
10. 신경의 근위부 끝에서 시작하여 한 쌍의 매우 미세한 끝이 있는 집게로 노출된 축삭 끝을 부드럽게 잡습니다.
11. 두 번째 겸자로 신경초를 근방으로 잡고 신경의 말단부를 향해 천천히 당깁니다. 신경초는 최소한의 저항으로 축삭을 따라 미끄러질 것입니다. 이 과정에서 신경에 과도한 긴장이 가해지지 않도록 하십시오.

4. 최종 신경 관혈 챔버 어셈블리

1. 신경의 근위부 끝을 잡고 식염수에서 제거하고 내부 개스킷의 직사각형 개구부 내에 있는 관류실의 커버슬립에 천천히 내려놓고, 신경을 똑바로 눕힐 때 신경에 부드러운 장력을 유지합니다.
2. 홈이 있는 면이 신경을 향하고 흐름의 방향이 신경과 평행하도록 하여 미세 수로 슬라이드를 신경 위에 놓습니다. 커버슬립과 미세화로 어셈블리를 뒤집고 미세수관 슬라이드가 외부 개스킷에 부착된 상태에서 관류 챔버 하우징 내에 놓습니다. 신경과 주변 내부 개스킷은 이제 개스킷으로 분리된 커버슬립과 마이크로 수로 슬라이드 사이에 끼워지며 커버슬립이 위를 향하도록 합니다(그림 1B).
3. 관류 챔버를 금속 하우징에 넣고 잠금 링을 회전시켜 고정합니다. 플라스틱 하우징이 모든 금속 클립 아래에 완전히 있는지 확인하고 식염수 누출을 방지하기 위해 잘 조입니다. 과도하게 조이면 마이크로 수로 슬라이드 또는 커버 슬립에 균열이 생길 수 있습니다. 커버슬립이 아래를 향하도록 챔버를 뒤집습니다.
4. 식염수 주사기 플런저를 천천히 눌러 관류 챔버를 채웁니다. 주입구 및 배출구 튜브, 배출구 플라스크 및 주사기를 설정 및 이미징 중에 항상 챔버 자체 위로 올려 두십시오. 이렇게 하면 기포가 발생하거나 챔버의 음압으로 인해 초점 불안정을 유발할 수 있는 사이펀을 방지할 수 있습니다.
5. 관류 어셈블리를 도립 현미경 스테이지로 옮기고 식염수 주사기를 주사기 펌프에 장착합니다. 0.25mL/분의 유속으로 적절한 속도로 모터를 시동합니다. 그런 다음 37°C로 설정된 인라인 용액 히터를 연결하고 켭니다.
6. 대물렌즈 히터를 연결하고 37°C로 설정하고 대물렌즈에 오일을 바르고 관류 챔버를 s에 삽입합니다.tage 마운트.
7. 챔버 히터 패드에 오일을 바르고 관류 챔버에 부착합니다. 챔버 히터를 연결하고 켜십시오. 37 °C로 설정합니다.
   참고: 온도 변화로 인해 용액의 가스 방출로 인해 관류 챔버에 기포가 형성될 수 있습니다. 기포가 형성되면 기포가 챔버를 제거할 때까지 용액 유속을 5-10배 잠시 증가시킵니다.
8. 관류 챔버를 s에 잠급니다.tage 어댑터를 선택하고 대물 오일을 챔버 아래쪽의 커버슬립과 접촉시킵니다.
   참고: 여기에 사용된 ASI 스테이지 어댑터가 있는 Bioptechs 챔버는 도립 현미경 구성용으로 설계되었습니다.

5. 형광 활성화 및 이미지 획득

1. 명시야 조명을 사용하여 커버슬립 표면에 가장 가까운 신경의 바닥 표면에 있는 축삭 층에 초점을 맞춥니다(그림 2B). 수초화된 축삭돌기(일반적으로 성체 마우스의 경우 직경 1 - 6 μm)는 수초(myelin sheath)의 존재로 식별할 수 있으며, 이는 대비 향상 없이 명시야 투과광 조명 아래에서 볼 수 있습니다. Schmidt-Lanterman의 갈라진 틈과 Ranvier의 마디도 쉽게 볼 수 있습니다. 수초화되지 않은 축삭돌기는 더 가늘고(일반적으로 직경 <1μm) 일반적으로 다발(Remak 다발)에 존재하며, 일반적으로 너무 밀접하게 결합되어 서로 분리되지 않습니다.
2. 현미경에서 사용할 수 있는 경우 자동 초점 시스템을 활성화하여 타임랩스 이미징 동안 초점을 유지합니다.
3. 명시야 참조 이미지를 획득합니다. 이미지에 대한 신경의 방향(척추-근위 및 원위 끝)을 기록합니다.
4. 488nm 레이저와 paGFP(예: 525/50nm)에 적합한 방출 필터를 사용하여 컨포칼 이미지를 획득하여 사전 표백 자가형광을 기록합니다. 광표백을 최소화하기 위해 레이저 출력을 낮게 유지하고 희미한 신호를 감지하기 위해 노출 시간을 적절하게 조정합니다. 예를 들어, 대표 데이터는 5% 레이저 출력과 4초 노출에서 획득되었습니다. 향후 모든 실험에 사용할 수 있도록 획득 설정을 기록합니다.
   참고: 광활성화 후 이상적인 이미징 설정은 20개의 이미지 과정에서 신호 대 잡음비가 8>되고 원래 신호의 25% 미만으로 광표백됩니다. 축삭돌기는 원래처럼 광시야 epifluorescence microscopy로 이미지화할 수도 있지만 공단면이 부족하여 이미지 품질이 떨어집니다.
5. 레이저 출력을 일반 이미징 출력의 약 5배로 설정하고 3-4분의 노출 시간으로 이미지를 획득합니다. 필수는 아니지만 이 단계는 배경 신호를 줄여 광활성 형광의 신호 대 잡음비를 최대화하기 위해 자가형광 및 기타 원치 않는 형광 소스를 표백하는 것이 좋습니다.
6. 이 표백 단계 후 사전 활성화 자가형광을 기록하기 위해 5.4단계에서 사용된 설정으로 이미지를 획득합니다.
7. 명시야 이미지에서 원하는 활성화 창 크기와 동일한 길이로 축삭돌기에 평행한 선을 그립니다. 이 창의 길이는 실험 목표와 매개변수에 따라 다르지만 일반적인 길이는 펄스 탈출 패러다임의 경우 5μm, 펄스 확산 패러다임의 경우 40μm입니다.
8. 이 선을 가이드로 사용하여 축삭돌기에 수직인 시야를 가로질러 직사각형 관심 영역(ROI)을 그립니다. 이 영역은 광활성화될 모든 축삭돌기를 포함해야 합니다.
9. 405nm 조명으로 광활성화를 위한 최적의 설정을 결정합니다.
   참고: 첫 번째 실험을 활성화하기 전에만 이 단계와 하위 단계를 수행하십시오. 실험이 진행되는 동안 동일한 광활성화 설정을 사용해야 합니다.
   1. 405nm 레이저 라인, 낮은 레이저 출력(예: 5%), 픽셀 체류 시간(예: 40μs) 및 하나의 펄스를 사용하여 관심 영역을 반복적으로 활성화하고, 각 활성화 후 활성화된 녹색 형광 단백질 또는 GFP 형광의 이미지를 획득합니다. 형광이 더 이상 증가하지 않을 때까지 반복한 다음 각 이미지의 관심 영역에서 형광을 정량화합니다.
   2. 평균 형광 강도 대 펄스 수를 표시합니다. 형광이 더 이상 증가하지 않는 펄스의 수를 활성화를 위한 최적의 펄스 수로 선택합니다.
10. 405nm 광으로 패턴화된 여기(patterned excitation)에 의해 5.8단계에서 그려진 영역에서 paGFP 형광을 활성화합니다. 활성화 직전과 직후에 이미지를 획득했는지 확인합니다.
    참고: 이상적인 paGFP 활성화는 관심 영역 또는 ROI 내에 포함된 날카로운 경계와 함께 명확하게 정의된 형광 영역을 생성합니다.
11. 활성화가 완료되면 1분 타이머를 시작합니다. 1분이 지나면 타임랩스 시리즈 획득을 시작합니다.
    참고: 1분 지연은 paGFP의 광활성화 후 관찰되는 형광의 증가를 허용하기 위해 필요합니다. 펄스 확산 방법의 경우, 30초 타임랩스 간격으로 5-10분의 획득 주기는 속도와 방향을 측정하기 위해 중앙 및 측면 창의 초기 경사를 측정하기에 충분합니다. 펄스 탈출 방법의 경우 5분 또는 10분 타임랩스 간격으로 30-150분의 획득 기간을 통해 필라멘트의 장기 일시 중지 동작을 분석할 수 있습니다.
12. 획득한 모든 이미지와 형광 활성화에 사용되는 ROI를 저장합니다.
13. 신경의 새로운 부위로 이동하여 5.1-5.11단계를 반복합니다. 새로운 영역이 동일한 축삭을 따라 있는 경우 다른 활성화된 영역에서 벗어난 형광 신경 필라멘트의 검출을 피하기 위해 이전에 활성화된 영역에서 최소 500μm 떨어져 있어야 합니다. 최종 타임랩스 획득은 3시간 창이 끝나기 전에 완료되어야 합니다.
    참고: 제제가 3시간 이상 지속될 수 있지만 확인되지는 않았습니다. 능숙한 해부 및 준비를 통해 이 3시간 내에 5개에서 8개의 10분 타임랩스 이미지 세트를 획득할 수 있습니다.
14. 최종 타임랩스 이미지 시리즈를 획득한 후 식염수의 흐름을 멈추고 용액과 챔버 히터를 분리한 다음 현미경 스테이지에서 관류 장치를 제거합니다.

결과

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
14 x 22 직사각형 개스킷 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30mm 원형 개스킷 w/ 구멍	Bioptechs	1907-08-750	외부 개스킷
35 x 10mm dish	Thermo Fisher	153066	Dissection dish
40mm 라운드 커버 슬립	40-1313-0319
60mL 주사기 - Luer-lock 팁	BD	309653
Andor Revolution WD 스피닝 디스크 컨포칼 시스템	andor		Perfect Focus 및 FRAPPA 시스템 장착
Calcium chloride	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	fluorescein 슬라이드의 경우
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
해부 핀	Fine Science Tools	26001-70
해부 겸자	Fine Science Tools	11251-30<
47 50 03
왁스로 해부 팬	Ginsberg Scientific	568859
해부 가위	Fine Science Tools	14061-09	초기 해부 가위
FCS2 관류 챔버	Bioptechs	60319-02-03
플루오레세인 나트륨	Fluka	46960
인라인 솔루션 히터	워너 인스트루먼트	SH27-B
Laminectomy 겸자	Fine Science Tools	11223-20	초기 해부 겸자
Magnesium sulfate	시그마 알드리치	M7506
Microaqueduct 슬라이드	Bioptechs	130119-5
현미경 슬라이드	Fisher	12-544-3	플루오레세인 슬라이드의 경우
현미경 스테이지 insert	Applied Scientific Instrumentation	I-3017	<
Objective heater system	Okolab		오코 터치 with objective collar
Objective oil - type A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA 목표	Nikon	MRD01901
염화칼	Fisher	P217
인산칼	Sigma-Aldrich	P0662
중탄산나트륨	Sigma-Aldrich	S6297
염화나트륨	Sigma-Aldrich	S7653
주사기 펌프	Sage Instruments	Model 355
튜빙 어댑터 - 암	Small Parts Inc.	1005109
튜빙 어댑터 - 수	Small Parts Inc.	1005012
타이건 튜빙	Bioptechs		1/16" ID, 1/32" 벽 두께
Vannas 스프링 가위	Fine Science Tools	15018-10	가위

< td style = '배경 색상 : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 패밀리 : Arial; 글꼴 크기 : 10pt; 글꼴 무게 : 정상; 오버 플로우 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 텍스트 정렬 : 가운데; 수직 정렬 : 하단; 공백 : 정상; 단어 줄 바꿈 : 단어 : 단어 바꿈; 랩 전략 : 4; '>Bioptechstd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Arial;font-size:10pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>미세한 팁 집게< td 스타일 = '배경 색상 : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Arial; 글꼴 크기 : 10pt; 글꼴 무게 : 정상; 오버 플로우 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; 흰색 공간 : 정상; 단어 줄 바꿈 : 단어 바꿈; 랩 전략 : 4; '>해부 현미경 < td 스타일 = '배경 색상 : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Arial; 글꼴 크기 : 10pt; 글꼴 무게 : 보통; 오버플로 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 텍스트 정렬 : 가운데; 수직 정렬 : 하단; 공백 : normal; 단어 줄 바꿈 : 단어 나누기; 랩 전략:4;' >Zeiss< td 스타일 = '배경 색상 : #ffffff; 오버 플로우 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; '> tr style='height:21px;'>륨륨