방법 논문

생쥐 강아지의 신경 형태학 이미징을 위한 이광자 현미경

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2025년 5월 29일

이 논문에서

초록

출처: Mizuno, H., et al. In Vivo 신생아 마우스의 피질 뉴런의 이광자 이미징. J. Vis. 특급. (2018)

이 비디오는 마취된 형질전환 생쥐 새끼의 뇌에 있는 뉴런을 이미지화하는 데 사용되는 이광자 현미경을 보여줍니다. 이광자 레이저는 높은 공간 해상도와 최소한의 광 산란으로 더 깊은 이미징을 가능하게 하여 수지상 투영을 포함한 신경 형태를 자세히 캡처할 수 있습니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리위원회와 JoVE 수의사에 의해 검토되었습니다. 검토 게시판.

1. 두개골 창 준비

  1. isoflurane(1.0% - 2.0%)을 사용하여 강아지를 마취하고 tail-pinch test로 마취 수준을 확인합니다.
  2. 멸균 된 면도날로 두개골을 조심스럽게 열어 경막 (직경 1mm)을 그대로 둡니다 (그림 1C). 피질 완충액(125mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl, 10mmol/L 포도당, 10mmol/L HEPES(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid), 2mmol/L CaCl<-1-span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>2<, and 2 mmol/L MgSO4; pH 7.4; 300 mOsm/L; 실온) 출혈을 멈추기 위해. 두개골을 열 때는 뇌 표면을 촉촉하게 유지하기 위해 피질 완충제를 바르십시오.
  3. 젤라틴 스펀지를 사용하여 경막 표면에서 완충액과 혈액을 제거합니다. 노란색 팁을 사용하여 1.0% 낮은 용융점 아가로스(피질 완충액에 용해됨)의 얇은 층을 적용합니다. 열 차단 기계를 사용하여 도포할 때까지 아가로스 용액의 온도를 42°C로 유지합니다.
    참고: 완충액과 혈액의 배출은 개두술 측면에서 수행해야 하며 건조 젤라틴 스펀지가 경막에 닿지 않도록 주의해야 합니다. 그렇지 않으면 경막이 손상될 수 있습니다.
  4. 아가로스 젤 층에 둥근 유리 커버슬립(1번, 직경 3mm)을 바릅니다. 커버슬립과 아가로스 젤 층 사이에 아가로스 젤을 과도하게 부어 모든 기포를 제거합니다. 핀셋 ( Figure 1D1E).
  5. 치과용 시멘트를 사용하여 커버슬립을 고정합니다(Figure 1F).
  6. 시멘트 분말과 시멘트 액체를 혼합하십시오. 혼합물이 응고되기 전에 노란색 팁을 사용하여 혼합물을 바르십시오. 경막에 치과용 시멘트를 바르면 뇌가 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
  7. 멸균 티타늄 바 (맞춤 제작, 약 30mg, <span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'그림 1G) 치과용 시멘트를 사용하여 두개골 뼈에 삽입한다. 티타늄 바와 커버슬립(dura 표면)을 병렬로 정렬하여 이미지를 쉽게 캡처할 수 있습니다.
  8. 치과 용 시멘트로 노출 된 두개골을 덮습니다 (Figure 1H).
  9. 마취에서 강아지를 회복하십시오. 치과 용 시멘트가 응고 될 때까지 (37 ° C) 히터 (1 °C)에 보관하십시오.

2. Two-photon Imaging

  1. 이광자 레이저 파장을 설정합니다. RFP(적색 형광 단백질) 여기의 경우 1,000nm(400μm 깊이에서 450mW/mm2)를 사용합니다.
    NOTE: 레이저 파워 z 위치가 위로 이동함에 따라 줄여야 합니다.
  2. 커버슬립 표면을 70% 에탄올로 닦습니다.
  3. 이소플루란(1.5% - 2.0%)을 사용하여 강아지를 마취하고 꼬리 꼬집음 테스트를 사용하여 마취 수준을 확인합니다.
  4. 강아지 머리에 있는 티타늄 막대를 사용하여 이미징 스테이지의 티타늄 플레이트에 강아지를 부착합니다(그림 2A 및 2B). 고니오미터 스테이지(Figure 2B). 발열 패드(37°C)를 사용하여 강아지의 체온을 유지하십시오.
  5. 이소플루란 농도를 0.7% - 1.0%로 설정합니다.
    NOTE: 매우 높은 이소플루란 농도는 이미징 중 강아지의 우발적인 죽음을 유발할 수 있습니다.
  6. 이미징 스테이지를 이광자 현미경(<span style='font-family:Roboto,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>그림 2B 및 2C).
  7. 커버슬립에 물 한 방울을 떨어뜨립니다. epi-fluorescence를 사용하여 경막이 노출된 영역에서 형광 단백질 표지 뉴런을 찾습니다.
  8. 1.4μm 간격으로 z-stack 이미지를 획득합니다. 레이어 4 뉴런 이미징의 경우 z-width를 150 - 300 μm로 설정하여 전체 수지상 형태를 이미지화합니다(Figure 2D 및 2E). 느린 스캔 및 평균화를 사용하여 신경 세포 형태를 보여주는 선명한 이미지를 얻습니다(전체 수지상 형태를 획득하는 데 일반적으로 > 20분 소요).
    참고: 이미징에 권장되는 매개변수는 다음과 같습니다. 여기 파장: 1,000 nm, 스캐너: 검류계형, 이색성 미러: 690 nm, 방출 필터: 575 - 620 nm 대역통과, 검출기: GaAsP 유형, 게인 설정 > 100, 이미지 크기 > 512 x 512 μm, 시야> 600 x 600 μm, 픽셀 해상도 < 1.2 μm.

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결과

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그림 1: 수술, 두개골 창 준비 및 티타늄 바 부착. (A) 이 패널은 두개골을 덮고 있는 피부가 제거된 것을 보여줍니다. (B) 이 패널은 피부와 두개골 사이...

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pK031. TRE-Cre작성자-사용 가능 RIKEN BRC 및 Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE작성자-사용 가능 RIKEN BRC 및 Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE작성자-사용 가능 authors
isofluraneWako099-06571
410 마취 장치 (isoflurane gas machine)Univentor8323101
Vetbond (조직 접착제)084-1469SB
MμltiFlex Round (로딩 팁) Sorenson13810
Gelfoam(젤라틴 스펀지)Pfizer09-0353-01
AgaroseSigmaA9793낮은 융점
둥근 모양의 coverslip-맞춤 제작
Unifast 2 (치과 시멘트)-
Titanium bar저자맞춤 제작 (그림 1G 참조)
Rimadyl (carprofen)-Injectable
2-photon microscopeZeissLSM7MP
티타늄-사파이어 레이저Spertra-PhysicsMai-Tai eHPDS
티타늄 플레이트Authors-맞춤 제작(그림 2A 참조)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE
Goniometer stageThorlabsGN2/M
< td style = 'background-color : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Roboto; 글꼴 크기 : 7pt; 글꼴 무게 : 보통; 오버플로 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; 공백 : normal; 단어 줄 바꿈 : 단어 나누기; 랩 전략:4;' >Matsunami < td 스타일 = '배경 색상 : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Roboto; 글꼴 크기 : 7pt; 글꼴 무게 : 보통; 오버플로 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; 공백 : normal; 단어 줄 바꿈 : 단어 나누기; 랩 전략:4;' >GC < td 스타일 = '배경 색상 : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Roboto; 글꼴 크기 : 7pt; 글꼴 무게 : 정상; 오버 플로우 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; 흰색 공간 : 정상; 단어 줄 바꿈 : 중단 단어; 랩 전략 : 4; '>- < td style = 'background-color : #ffffff; 색상 : #1a202c; 글꼴 가족 : Roboto; 글꼴 크기 : 7pt; 글꼴 무게 : 보통; 오버플로 : 숨김; 패딩 : 0px 3px; 수직 정렬 : 하단; 공백 : normal; 단어 줄 바꿈 : 단어 나누기; 랩 전략:4;' >Zoetis

재인쇄 및 허가

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