초파리 뇌 구조에서 칼슘 과도 현상을 연구하기 위한 생물 발광 이미징

초록

출처: Lark, A. R., et. al., 생물 발광 칼슘 지표 GFP-aequorin을 기반으로 한 생체 내 기능적 뇌 이미징 접근 방식. J. Vis. Exp. (2016)

이 비디오는 Green을 사용한 칼슘 역학의 실시간 이미징을 보여줍니다. 초파리 심부 뇌 구조에서의 형광 단백질-aequorin 생물 발광.

프로토콜

1. 이미징

1. 설정
   1. 현미경, 컴퓨터, 카메라, 배수 시스템을 켜고 실내 환경 제어를 25°C로 설정하여 기록 시스템을 시작합니다.
   2. 측정을 열고 컴퓨터의 자동화 탐색기 프로그램. "Devices and Interfaces"를 클릭한 다음 "NI Motion Devices"를 더블 클릭하고 마지막으로 "PCI-7334"를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 "initialize device"를 선택합니다.
   3. Photon Imager를 엽니다. 새 폴더를 만들고 첫 번째 녹음 파일의 이름을 지정합니다. 시스템이 작동하려면 카메라가 -80°C에 도달해야 합니다.
   4. 관류 시스템 설정: KCl(염화칼륨), 니코틴 및 Ringer's 용액을 저장소에 추가하고 각 용액이 2ml/분으로 방전되도록 조정합니다. 실험을 시작하기 전에 Ringer의 용액으로 세척하십시오.
2. 샘플 준비
   1. 이미징 마운트 블록 접시를 5X 배율의 현미경으로 마운트에 놓고 천공을 통해 채널에 관류 튜브를 삽입합니다.
   2. 현미경을 형광등 모드로 설정한 다음 중앙에 놓고 버섯체(MB)에 초점을 맞춥니다. 20X로 조정하고 다시 중심을 잡은 다음 초점을 맞춥니다.
   3. 배수 장치를 배수 풀 위에 배치하고, 팁이 풀 바로 위에 오도록 배수 션트의 높이를 조정하고, 적절한 배수를 보장하기 위해 Ringer의 솔루션을 30초 동안 실행합니다. 위치
   4. 실드를 아래로 당겨 장치를 빛으로부터 밀봉하십시오. 광자 이미저의 자동화 시스템을 사용하여 초점을 미세 조정하고 MB의 기준 형광 이미지를 촬영합니다.
3. 녹음
   1. 광자 속도를 원하는 기록 속도(50msec에서 최대 1초 이상)로 조정합니다. 광자 모드를 선택하고 셔터를 엽니다. 로그 항목에 유전자형, 성별, 나이 및 샘플 번호를 기록합니다. ROI 상자를 클릭하고 Ctrl 키를 누른 상태에서 드래그하여 꽃받침 및 세포체(CCB) 및 내엽 위의 ROI(관심 영역) 상자의 위치를 조정합니다.
   2. 약 5분에서 10분 동안 기준선을 기록합니다(원하는 대로).
   3. 1분 동안 니코틴을 바르십시오. 로그에서 시작/중지를 기록하십시오. Ringer의 용액으로 5분 동안 세척합니다.
   4. 회복을 위해 5분 동안 기다렸다가 KCl(염화칼륨) 로그 항목 및 타이머를 준비합니다.
   5. KCl을 1분 동안 바릅니다. 로그에서 시작/중지를 기록하십시오. Ringer의 용액으로 1분 동안 세척합니다.
   6. 형광 모드로 전환하고 최종 형광 이미지를 촬영한 다음 Ringer의 용액을 끕니다.
   7. "중지"를 누릅니다. 시스템을 종료할 것인지 묻는 대화 상자가 나타납니다. 녹음을 계속하려면 "아니오"를 선택하십시오.
   8. 쉴드를 열고 배수 시스템을 이동하고 렌즈 대물렌즈를 5X로 전환하고 관류 튜브를 제거합니다. s를 제거하십시오.ample/녹음 접시tage, 렌즈를 물로 두 번 헹구고 닦아 20X 렌즈를 청소합니다.
   9. 프로그램 창 상단에 있는 흰색 재생 버튼을 눌러 다음 녹음을 시작합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Calcium chloride	Merck	1023911000
HEPES	시그마 알드리치
염화칼륨	26 764.298
염화 마그네슘	Prolabo
Sucrose	시그마 알드리치
니코틴
ATP	아데노신 5'-트리포스페이트 이나트륨 염 수화물
벤질 콜렌 테라진	http://www.prolume.com/
피펫 팁	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipette Tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (-80°C로 냉각)
현미경	이클립스 -E800
Immersion objective lens	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
형광을 이용한 해부 현미경	Leica MZ Fl III	N/A	leica dissection scope and flurescent lamp
연동 펌프	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	두께에 따라 다름)	Tygon R3603, St-Gobain
관류 시스템	관류 밸브 제어 시스템, 완료, 핀치 밸브 포함, 6채널
perfusion regulators	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	소프트웨어 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	소프트웨어 https://www.microsoft.com
가상 dub	오픈 액세스	소프트웨어 http://virtualdub.sourceforge.net/

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