제브라피시 라라바(Larava)에서 이광자 현미경을 사용한 표적 신경 세포 절제

초록

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 신경 세포 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가.J. Vis. Exp. (2018)

이 비디오에서, 이광자 레이저 절제 절차가 시연되어 아가로스에 고정된 제브라피시 유충에서 형광 뉴런을 선택적으로 파괴할 수 있습니다. 시술 전후의 고해상도 이미징은 형광의 부재로 관찰되는 바와 같이 효율적인 신경 손상을 확인합니다.

프로토콜

1. 이광자 레이저 현미경을 사용한 뉴런 부분 모집단의 절제

1. 연구할 특정 뉴런과 UAS:EGFP 또는 UAShspzGCaMP6를 라벨링하는 Gal4 라인의 짝짓기를 설정하여 시작합니다. nacre background를 사용하여 <span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>nacre 동형접합자를 얻을 수 있습니다.
   참고: <span style='font-family:Roboto;font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>nacre 본체 표면에 멜라노포어를 포함하지 않습니다(그림 1B). 본 연구에서는 Gal4 라인 gSAIzGFFM119B(프리텍텀 라벨링)와 다른 Gal4 라인 hspGFFDMC76A(ILH(시상하부의 로브)를 라벨링)가 사용됩니다.

2. 짝짓기 설정 다음 날, 제브라피쉬 알을 모아 관심 뉴런이 형광 리포터를 발현하는 유충 단계로 올립니다.

3. 제브라피시 유충을 2% 저융점-아가로스에 장착합니다(그림 1B).

1. 2% 아가로스 원액을 준비하여 시작: 2g의 저융점 아가로스 분말을 100mL 시스템 물에 용해시킵니다(즉, 순환 수계에서 다 자란 제브라피시를 유지하는 데 사용되는 물) 또는 E3 물, 전자레인지에서 물을 끓는점까지 가져오고 격렬하게 혼합합니다.

   1. 2%의 낮은 용융점 아가로스 스톡을 끓을 때까지 전자레인지에 돌립니다. 3.5-4.0mL의 아가로스를 6cm 페트리 접시 뚜껑에 붓습니다. 계속하기 전에 아가로스가 식을 때까지 기다렸다가 만졌을 때 따뜻해집니다.

   2. 다음으로, 아가로스에 한 마리의 유충(이 단계에서 마취되지 않음)을 놓습니다. 해부 바늘(그림 1C)을 사용하여 유충이 똑바로 서도록 유충의 위치와 방향을 계속 조정하여 아가로스가 응고되어 유충의 적절한 위치를 보장할 때까지 합니다.
      참고: 아가로스가 굳어지는 동안 애벌레는 계속 헤엄칠 것입니다.

   3. 유충이 배치되면 아가로스가 완전히 굳을 때까지 5분 정도 기다립니다.

   4. 아가로스 위에 트리카인 용액 5mL(1x 작업 농도에서 0.4%)를 붓습니다.
      참고: 레이저 절제 중 유충의 움직임을 피하기 위해 유충은 절제 절차 내내 마취 상태를 유지해야 합니다.

4. 이광자 레이저 현미경 시스템에서 표백 기능을 사용하여 유충을 제거합니다.

1. 아가로스에 박힌 유충을 이광자 레이저 스캐닝 현미경 아래에 놓고 현미경 시스템을 시작합니다.

2. 이미지 획득 소프트웨어를 시작하고 레이저를 켜려면 "레이저" 탭의 "켜기" 버튼을 클릭하십시오 (그림 1D). 레이저의 "상태"가 "사용 중"에서 "모드 잠금"으로 변경될 때까지 기다립니다.

3. "채널" 탭에서 레이저의 파장을 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein) 절제의 경우 880nm(최대 출력: 약 2,300mW) 또는 GCaMP 절제의 경우 800nm(최대 출력: 약 2,600mW)로 설정합니다.

4. 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 20X 대물 렌즈를 선택하십시오. "찾기" 탭을 클릭하고 "GFP"(녹색 형광 단백질)를 클릭하여 광학 경로를 변경하고 눈으로 형광을 직접 볼 수 있습니다.

5. 시야 중앙에서 제브라피시 애벌레 뇌를 찾습니다. 그런 다음 "Acquisition" 탭을 클릭하여 이광자 현미경으로 돌아갑니다.

6. '절제 전' 조건의 기록으로, 빠른 스캔 속도로 20X 대물렌즈로 z-stack 이미지를 촬영합니다(열 손상을 방지하기 위해). 나중에 절제 실험 전후에 촬영한 이미지를 비교합니다(그림 2A). z-스택을 얻으려면 "Z-스택"을 클릭하여 z-stack 옵션을 선택하고 탭을 확장합니다. 애벌레 뇌의 복부 말단에 초점을 맞춘 후 하한선을 설정하고("Set First" 버튼 클릭), 뇌의 가장 등쪽 표면에 초점을 맞춘 후 상한을 설정합니다("Set Last" 버튼 클릭). 그런 다음 "실험 시작" 버튼을 클릭하여 z-stack 이미지 획득을 실행합니다.

7. 렌즈 리볼버를 수동으로 움직여 63X 대물 렌즈를 선택하십시오.

8. "찾기" 탭을 클릭하여 epi-fluorescent microscopy로 전환하고, 눈의 시야 중심에서 절제할 세포를 찾은 다음, "Acquisition" 탭을 클릭하여 레이저 스캐닝 현미경으로 돌아갑니다.

5. "Acquisition Mode" 탭에서 "Frame Size"를 256 x 256으로 설정합니다. "Live"를 클릭하고 관심 있는 뉴런을 관찰합니다.

6. 가장 등쪽에서 시작하여 절제할 세포에 초점이 맞춰진 초점면을 찾습니다.

7. "Regions" 기능을 사용하여 각 뉴런의 세포 지름의 약 1/3 크기의 작은 원형 영역을 관심 영역(ROI)으로 표시합니다.

8. 스캔 속도를 13.93 s/256 x 256 픽셀(134.42 μm x 134.42 μm)로 설정하며, 이는 약 200 μs/픽셀 또는 200 μs/0.5 μm의 레이저 체류 시간에 해당합니다. 또한 4회 반복을 설정합니다('반복 주기: 4'). 또는 반복 횟수와 스캔 속도를 최적화하여 충분한 절제를 달성할 수 있습니다.

9. 'Time series (2 cycles)'와 함께 절제를 위한 'Bleaching' 기능을 수행하여 샘플(절제 전후) 및 'Regions'(ROI 설정) 또는 사용된 소프트웨어에서 이에 상응하는 기능을 이미지화합니다(그림 1D).

10. 시계열 주기에서 첫 번째 이미지(절제 전)와 두 번째 이미지(절제 후)를 비교하여 표백 후 대상 세포의 형광이 배경 수준에서 관찰된 형광으로 감소하는지 확인합니다(그림 2B).

11. 절제 후에도 형광이 여전히 존재하면 반복 횟수를 늘리십시오.

12. 다음으로, 초점면을 약간 더 깊게 이동합니다(i.e., 복부 쪽을 향해)을 선택하고 절제되지 않은 세포가 나타나는 다음 초점면을 선택합니다.

13. 표백 기능을 수행합니다. 관심 신경 구조의 모든 세포가 절제될 때까지 이 단계를 반복합니다.

14. 절제할 신경 구조를 덮고 있는 모든 초점면을 거친 후, 세포에 폐형이 있는지 확인합니다. 불충분한 절제로 인해 일부 세포가 여전히 형광을 발하는 것으로 확인되면 위에서 설명한 대로 다시 레이저를 조사합니다.

15. 레이저 조사 후 아가로스에서 유충을 회수해야 하는 경우, 유충을 손상시킬 수 있으므로 아가로스에서 강제로 빼내려고 하지 마십시오. 대신, 유충 주위의 아가로스를 몸 표면에 수직으로 조심스럽게 작게 자릅니다. 그런 다음 마취제가 사라지면 유충이 스스로 아가로스에서 헤엄쳐 나올 때까지 기다립니다.

16. 절제를 위해 다음 유충으로 진행하거나 조사 중인 행동에 관여하지 않은 다른 뉴런 집단을 사용하여 대조 실험을 수행합니다.
    참고: 여기서, 대조군으로서, UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B 유충은 위에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 사용하여 레이저 절제되었습니다(그림 2A, 오른쪽).

17. Ca 이미징 또는 행동 기록을 진행하기 전에 회복을 위해 몇 시간 또는 1일을 허용합니다. 이 회복 시간 동안 애벌레 건강 상태를 확인하고(i.e., 정상적인 자연 수영, 절제 부위 주변에 명백한 열 손상 없음, etc.) 징후가 있는 유충을 제거합니다. 건강이 좋지 않습니다.

결과

재료