마우스 뇌 미세혈관 구조의 생체 내 이미징을 위한 이광자 현미경

초록

Source: Nishimura, C. 외. HIV-induced Neuroinflammation의 마우스 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 대뇌 혈관 건축의 정량화. J. Vis. 특급. (2016).

이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 마우스 뇌의 피질 모세혈관의 생체 내 시각화를 보여줍니다. 얇은 두개골 피질 창이 있는 마취된 마우스에 형광 염료를 주입하고, 이미징을 위한 설정을 준비하고, 분석을 위해 뇌 미세혈관 구조의 상세한 이미지를 획득하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 형광 염료 주입

1. #5 집게를 사용하여 왼쪽 허벅지 내측에 마취된 쥐의 피부를 꼬집습니다. 피부를 부드럽게 위로 당기고 가위를 사용하여 피부를 자르고 제거합니다. 덱스트란 복합 적색 발광 로다민 염료(70kDa)(식염수에 용해된 10mg/kg)를 준비합니다.
2. 대퇴 정맥을 찾습니다. 30G 바늘이 부착된 1ml 주사기를 사용하여 이미징에 적합한 미리 준비된 형광 염료 용액을 주사기의 130μl 라인에 그립니다. 염료를 주사기에 완전히 주입하고 주사기 벽을 단단히 두드려 모든 기포를 제거합니다.
   1. 30G 바늘을 단단한 표면의 경사면이 위로 향하게 하여 눌러 약 30도 각도로 구부립니다. 바늘에 염료를 채우고 과도한 액체를 버리고 100μl의 샘플을 남깁니다.
3. 100μl의 염료 샘플을 대퇴 정맥에 천천히 주입합니다. 바늘을 제거한 후 출혈을 멈추기 위해 주사 부위에 꾸준하고 부드러운 압력을 가합니다. 염료가 5분 동안 순환하도록 합니다.
4. 4-0 봉합사로 피부를 꿰매어 왼쪽 허벅지를 닫은 다음 마우스를 조심스럽게 배에 뒤집어 마우스 헤드플레이트 하네스에 넣습니다.
   

2. 생체 내 Two-Photon Imaging

1. 수술 기구를 이광자 현미경으로 옮겨 지속적인 마취 수준을 유지하도록 합니다. 소량의 0.9% 식염수를 헤드플레이트 저장소에 넣고 현미경 대물렌즈를 내려 식염수와 접촉하도록 합니다. 명시야 보기 대물렌즈를 사용하여 관심 영역을 찾습니다.
2. 이광자 레이저 여기를 형광 염료에 적합한 파장으로 설정합니다. 25x 대물렌즈를 사용하여 이광자 이미징을 시작합니다.
   이 실험에서는 780nm의 파장에서 여기된 적색 방출 로다민 염료에 접합된 덱스트란을 사용했습니다. 염료의 형광을 검출하기 위해 607/36 대역통과 방출 필터를 사용하였고, 동맥 자가형광을 검출하기 위해 480/20 대역통과 방출 필터를 사용하였다.
3. 보기 화면에서 모세관 침대를 찾고 광학 줌 2를 사용하여 이 영역을 확대합니다. 이광자 이미징 소프트웨어를 사용하여 모세혈관의 이미지를 획득합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
텍사스 레드 덱스트란 (70,000 MW, 식염수에 용해 된 10 mg / kg)	Invitrogen	D-1830
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 다광자 현미경	올림무스	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa 레이저	Spectra-Physics
Amira Software	Visage Imaging