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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. FLIM 데이터 획득
참고: 이 프로토콜에서 형광단의 수명은 시간 영역 TCSPC 방법을 통해 획득됩니다. FLIM은 레이저에 의해 설정된 일정한 반복 속도로 광 펄스를 생성해야 합니다. 반복률은 레이저 유형에 따라 다르며 사용자가 알고 있어야 합니다. 수명 측정은 기존 현미경과 함께 설치된 검출기 및 전자 장비에 의해 이루어집니다. 이 프로토콜에서는 mRFP, CFP 및 YFP 수명을 획득하기 위해 각각 두 개의 다른 회사(재료 표)에서 제공하는 검출기와 소프트웨어를 사용하여 세 가지 다른 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 측정을 수행합니다. 발광/여기의 올바른 필터가 제자리에 있는지 확인하고 시작하기 전에 배경 또는 모니터 백라이트를 최소화하십시오. 실험을 시작하기 전에 선택한 형광단의 광안정성을 확립하십시오. 형광단이 선충 조직 내에서 짧은 시간 내에 표백하는 경우 C. elegans의 FLIM 측정에 적합하지 않습니다.
- FLIM 수집 소프트웨어를 엽니다. FLIM 소프트웨어를 사용하면 컨포칼 현미경을 제어할 수도 있습니다. 검출기의 출력을 활성화할 수 있는 탭/버튼을 찾아 출력 활성화를 누릅니다.
- 기기 설정의 타이밍 정밀도를 설명하는 IRF(Instrument Response Function)를 획득합니다.
참고: 이 단계는 선충을 장착하기 전에 수행하는 것이 좋습니다. - 가능한 경우 여기/방출 필터를 제거합니다.
- 위치 대물렌즈 위에 빈 커버슬립을 놓고 표면을 찾으십시오. 커버슬립에서 얻은 산란 신호를 최소 30초 동안 기록합니다.
참고: 수 나노초의 수명 동안 수집 소프트웨어는 IRF 이동을 자동으로 추정할 수 있습니다. IRF를 획득하는 것은 항상 권장됩니다.
- C. elegans가 장착된 슬라이드를 스테이지에 놓습니다. 투과 모드에서 10배 확대 렌즈를 사용하여 슬라이드에서 선충의 위치를 파악합니다.
- 슬라이드를 제거하고 대물렌즈를 63배 확대 렌즈로 전환한 다음 필요한 침지 매체(예: 오일)를 적용합니다. 스테이지의 슬라이드를 교체하고 선충의 위치를 파악합니다.
- 획득 소프트웨어에서 핀홀 매니저를 찾아 최대를 엽니다. 샘플 스캔을 시작하고 관심 영역(예: 머리, 상체)을 선택한 다음 최대 투영 평면에 초점을 맞춥니다.
- 레이저 펄스 속도와 소프트웨어 인터페이스에 존재하는 다른 세 가지 값을 모니터링합니다: Constant Fraction Discriminator (CFD), Time-to-Amplitude (TAC) 및 아날로그-디지털 변환기 (ADC).
참고: 레이저의 최대 게이트는 1 x 108 단일 광자 수여야 합니다. 이 숫자는 레이저가 공급하는 최대 광자 수를 나타냅니다. CFD는 검출기에 의한 레이저 펄스와 관련하여 단일 광자 펄스의 수신에 대한 정보를 제공합니다. 이 값은 대략 1 x 105이어야 합니다. TAC는 하나의 광자가 검출된 시간과 다음 레이저 펄스를 구별합니다. 마지막으로 ADC는 TAC 전압을 저장 가능한 메모리 신호로 변환합니다. CFD, TAC 및 ADC는 형광단에서 방출되는 광자가 손실되지 않도록 모두 유사한 값을 가져야 합니다. 이러한 매개변수를 올바르게 평가하면 정확한 수명 맵을 생성하기에 충분한 광자가 수집되고 있는지 확인할 수 있습니다. - FLIM 소프트웨어의 인터페이스에서 감지된 광자의 수를 미리 볼 수 있습니다: ADC 값은 1 x 104 및 1 x 105 사이여야 합니다. 필요한 경우 초점을 다른 평면으로 이동하거나 레이저 출력을 높여 더 많은 광자를 수집합니다.
참고: 일반적으로 초당 기록된 광자의 수는 레이저 반복률의 1%를 초과해서는 안 됩니다. - 메뉴 모음에서 탭을 선택하여 획득 매개 변수를 설정합니다. 스캔 동기화를 선택하여 단일 광자 감지를 허용합니다.
- 획득을 고정된 시간 또는 고정된 광자 수로 설정합니다. 예를 들어, 2분 동안 또는 단일 픽셀이 2,000개의 단일 이벤트의 광자 수에 도달할 때까지 수명 감쇠 곡선을 획득합니다. 시작을 눌러 획득을 시작합니다.
참고: 형광단마다 다른 여기 및 방출 레이저와 필터가 필요합니다. 샘플의 밝기에 따라 레이저 출력도 조정할 수 있어 수명을 방해하지 않습니다. 이러한 프로토콜은 YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm와 같은 여기/방출 설정을 사용합니다. ex800/em440 nm를 사용한 CFP 측정에는 펄스 2광자 레이저가 사용되었습니다. FLIM 맵을 획득하는 데 필요한 시간과 광자 수는 각 설정 및 각 실험 목적에 대해 경험적으로 설정되어야 합니다.
2. FLIMfit 소프트웨어를 사용한 FLIM 데이터 분석
참고: 임페리얼 칼리지 런던에서 개발한 FLIMfit 소프트웨어 도구를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다(그림 그림 1 참조).
- 소프트웨어를 열고 File | FLIM 데이터를 불러옵니다. 하나의 조건에서 모든 샘플을 로드하며, 이는 다른 세션과 다른 생물학적 반복에서 얻은 경우에도 마찬가지입니다.
- 필요한 경우 Segmentation | 세분화 관리자. 강조 표시될 때까지 관심 영역 주위로 자르기 도구를 드래그합니다. 완료되면 확인을 누릅니다.
참고: 모든 이미지에 대해 세분화를 수행해야 합니다. - C. elegans의 강도 기반 이미지가 나타나는 작은 영역을 선택합니다(그림 1, 화살표 1). 해당 영역의 감쇠 곡선은 인터페이스 오른쪽의 큰 감쇠 창에 나타납니다(그림 1{{TAG_304 TAG_303 TAG_302 TAG_305}}, 화살표 2).
참고: 감소는 선형 또는 로그로 표시될 수 있습니다. - 2.5-2.8단계에 설명된 대로 소프트웨어의 알고리즘을 통해 수명을 추정하기 위해 올바른 매개변수를 설정합니다.
- 데이터 탭(그림 1, 화살표 3):{{TAG_343{{TAG_344 임의의 통합 최소값 값을 설정하여 너무 어두워서 생성할 수 없는 픽셀을 제외합니다. 핏이 좋습니다. C. elegans 샘플에 따라 이 값은 40-300까지 다양합니다. 만족스러운 미리보기가 나올 때까지 다른 값을 입력합니다.
- 시간 최소 및 {{TAG_371시간 최대 숫자를 선택하여 FLIM 신호를 이 값으로 제한합니다. 이 임계값 이전과 이후에 나타나는 모든 이벤트는 제외됩니다.
참고: 예를 들어, mRFP 분석을 위해 800ps 이전 및 4,000ps 이후의 이벤트는 제외되었습니다. 이러한 값은 형광단의 수명에 따라 달라지며 최종 사용자가 결정해야 합니다. - 프리셋 Counts/Photon을 1로 변경하지 마십시오.
- 획득 중에 사용된 레이저의 반복률을 MHz 단위로 입력합니다.
참고: 현재 프로토콜의 경우 다양한 반복률로 다른 레이저가 사용되었습니다. CFP 수명 획득에 사용되는 두 광자 레이저는 80MHz의 반복률을 가지며 YFP의 경우 레이저가 40MHz에서 반복되고 mRFP의 경우 값이 78.01MHz입니다. 이 값은 분석된 샘플에 따라 FLIMfit에 입력되었습니다. - 채도가 높은 모든 픽셀을 제외하려면 게이트 최대 값을 입력합니다.
참고: C. elegans의 수명 측정의 경우 이 값은 큰 숫자(예: 1 x 108)로 설정됩니다.
Lifetime 탭에서 사용할 전역 피팅(예: 픽셀 단위 피팅)을 선택합니다. 그림 1, 화살표 4 참조.
참고: 픽셀 단위 맞춤은 각 개별 픽셀에 맞는 감쇠를 생성합니다. 이미지 측면 피팅은 각 개별 이미지의 전역 피팅을 생성하고 이미지당 단일 수명 값을 표시합니다. 전역별 피팅은 전체 데이터 세트에서 단일 피팅을 생성합니다. 모든 이미지에 대해 단일 수명 값이 제공됩니다. No를 제외한 다른 매개변수는 변경하지 마십시오. Exp 선택: 선택한 형광 붕괴가 다지수적이고 단일 수명 이상을 나타내는 것으로 알려진 경우.
참고: 본 프로토콜에서 이 함수는 이중지수 CFP 형광단의 수명을 계산하는 데 사용되었습니다. IRF 메뉴를 통해 IRF를 업로드하십시오: IRF | IRF를 로드합니다. IRF 이동을 추정하려면 IRF | IRF 이동을 추정합니다. 값 집합이 IRF 탭에 자동으로 나타납니다. 설정이 완료되면 이 탭의 다른 매개변수를 변경하지 마십시오.모든 매개변수가 설정되면 데이터 세트 맞추기 (그림 1, 화살표 5). 알고리즘은 감쇠 곡선에 대한 피팅을 생성하고 각 이미지에 대한 수명 값을 설정합니다.
참고: 파란색 선으로 강조 표시된 결과 피팅은 모든 이벤트와 겹쳐야 합니다. 모든 이벤트가 적합을 따라 정렬될 때 양호한 적합을 얻습니다. 소프트웨어 인터페이스의 오른쪽 상단 메뉴에 있는 매개변수 탭(그림 1, 화살표 6)을 클릭하고 Statistic: w_mean (weighted mean)를 선택하고 {{TAG_595chi2{{ TAG_598}} 값은 가능한 한 1에 가깝습니다.
참고: chi2가 1에 가까우면 맞춤의 정확성이 보장됩니다. 따라서 선택한 이미지의 수명 값은 tau_1로 표시됩니다. 관심 있는 정보 내보내기: 파일 | Intensity Images/Fit Result Table/Images/Histograms를 내보냅니다. 수명을 계산하는 데 사용되는 데이터 설정을 저장합니다: File | 데이터 저장 설정.
참고: 사용된 매개변수는 선택한 샘플의 향후 분석을 위해 저장됩니다. 3. FLIM 데이터의 그래픽 표현
참고: 서로 다른 샘플에서 수집된 수명은 다양한 방법으로 시각적으로 표현될 수 있습니다. 수명 값을 나노초 또는 피코초 단위로 나타내려면 선택합니다.
- 감쇠 곡선을 FLIMfit에서 직접 내보내어 피팅의 품질과 곡선의 정확도를 표시합니다.
- 광자의 분포를 히스토그램의 수명 값 대비 광자 개수의 빈도 를 플로팅하여 나타냅니다.
- 마지막으로, 통계 비교를 위해 두 개 이상의 샘플을 비교하는 경우 수명 값과 평균의 표준 편차를 산점도 막대 그래프에 배치합니다. 원하는 통계 분석을 수행합니다.
