마우스 망막 원뿔 광수용체의 칼슘 역학을 모니터링하기 위한 이광자 현미경 검사

초록

출처: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca²⁺ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina. J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 형질전환 마우스 망막의 원뿔 광수용체에서 칼슘 역학을 모니터링하기 위해 이광자 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 망막 절편을 준비하고, FRET 기반 칼슘 바이오센서를 이미징하고, 형광 변화를 분석하여 배경 조명 및 빛 자극 하에서 칼슘 수치를 정량화하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 슬라이스 준비 (10 - 15 분)
   1. 망막 슬라이싱을 위한 니트로셀룰로오스 필터 멤브레인과 슬라이스를 장착하고 기록 챔버로 옮기기 위한 유리 커버슬립을 미리 준비합니다. 니트로셀룰로오스 필터 멤브레인을 가위를 사용하여 약 10 x 5mm 크기의 직사각형 조각으로 자릅니다. 유리 절단기를 사용하여 커버 슬립을 약 10 x 5mm 크기의 직사각형 조각으로 자릅니다.
   2. 유리 슬라이드를 조직에 가까운 세포외 용액에 천천히 담그십시오. HR2.1:TN-XL Ca²⁺ 바이오센서 마우스에서 얻은 망막 슬라이스를 한 쌍의 집게를 사용하여 가장자리를 잡고 신경절 세포 면이 위로 향하게 하여 유리 슬라이드로 부드럽게 당깁니다. 이 과정은 기계적 손상과 조직의 접힘을 줄입니다.
   3. 해당 연구 질문과 관련된 망막 영역을 선택합니다. 구부러진 메스 날을 사용하여 선택한 망막 영역에서 약 1 x 2mm 크기의 직사각형 조각을 잘라냅니다. 조직 주변의 과도한 용액을 닦아냅니다.
   4. 신경절 세포 쪽이 망막에 부착되도록 망막 조각 위에 필터 멤브레인을 놓습니다. 즉시, 세포외 배지 한 방울을 멤브레인에 떨어뜨려 조직을 멤브레인에 단단히 부착합니다.
   5. 멤브레인에 장착된 망막 조직을 새로운 세포외 용액이 들어 있는 슬라이싱 챔버로 옮깁니다.
   6. 티슈 초퍼에 부착된 새 면도날을 사용하여 망막을 200μm 두께의 수직 조각으로 자릅니다(그림 1B). 모든 망막 조각의 칼날을 교체하십시오.
      참고: 면도날은 절단 시 "딸깍" 소리로 표시된 것처럼 전체 멤브레인이 동시에 분할되도록 슬라이싱 챔버 바닥의 표면과 완벽하게 정렬되어야 합니다. 그렇지 않으면 날이 구부러져 슬라이스가 손상될 수 있습니다.
   7. 멤브레인 끝 부분에만 고진공 그리스를 바르면 멤브레인 장착 슬라이스 하나를 유리 커버슬립에 붙입니다(그림 1C). 망막 아래의 유리 표면에 기름기가 묻지 않도록 하십시오.
   8. 세포 외 용액 한 방울로 덮인 커버슬립 장착 조각을 보관 챔버(예: 밀폐된 차광 용기, 예: 뚜껑이 알루미늄 um 호일로 덮인 페트리 접시)에 실온(RT)의 카빈 분위기 아래에 두십시오. 수용실의 대기를 가습된 상태로 유지하기 위해 작은 저수지를 버블링하여 카바산소를 도입합니다. 이렇게 하면 조각이 마르는 것을 방지할 수 있습니다.
   9. 슬라이스를 10 - 15분 동안 보관실에 두었다가 (하나씩) 기록 챔버로 이동합니다. 슬라이스는 RT(~21°C)의 홀딩 챔버에서 최대 4-5시간 동안 유지될 수 있습니다.

2. 이광자 Ca²⁺ 이미징

1. 이광자 현미경
   1. 이동식 객관식 현미경(MOM)형 이광자 현미경을 사용하십시오.
      참고: 다음의 최소 요구 사항을 충족하는 모든 직립 이광자 현미경을 사용할 수 있습니다: (a) ~860nm로 조정할 수 있는 펄스 레이저, (b) 최소 2개의 동시에 획득된 형광 채널, (c) 강화 청록색 형광 단백질(eCFP) 및 황수정 형광을 위한 필터, (d) 광 자극기, (e) 관심 있는 Ca²⁺ 신호를 해결하기에 충분한 프레임 속도로 타임 랩스 이미지 시퀀스를 기록할 수 있는 소프트웨어.
   2. 제조업체에서 지정한 대로 이광자 이미징 시스템을 시작합니다. 시설의 레이저 안전 지침을 엄격히 준수하십시오. 레이저를 시작하고 ~860nm로 조정합니다.
   3. 홀딩 챔버에서 레코딩 챔버로 슬라이스를 옮기고 즉시 탄수화물화 세포외 용액으로 관류를 시작합니다. 기록 챔버에서 2ml/min의 관류 유속과 37°C의 온도를 유지합니다.
   4. 20X 0.95 개구수(NA) 침수 대물렌즈를 사용합니다. 가능한 경우 CCD(charge-coupled device) 카메라와 녹음실 아래의 적외선 발광 다이오드(LED)를 함께 사용하여 망막 슬라이스를 찾습니다(그림 2). 그렇지 않으면 이광자 이미징을 사용하여 슬라이스를 찾습니다(2.1.5 참조).
   5. 이광자 이미징으로 전환하여 바이오센서 발현을 볼 수 있습니다. eCFP 및 황수정의 형광 이미징을 위해 두 개의 검출 채널을 켭니다.
   6. 이광자 현미경을 제어하는 이미지 획득 소프트웨어를 사용하여 기록할 원뿔 단자 행을 스캔하고 선택합니다(그림 3A). 이미지 획득을 128 x 16 픽셀 이미지(31.25Hz) 또는 이와 유사한 구성으로 설정합니다. 외부 세그먼트에서 광색소가 표백되는 것을 방지하기 위해 스캔된 영역을 원뿔 단자로 제한하십시오.
      참고: TN-XL 칼슘 센서의 경우(τ = Ca²⁺ 바인딩의 경우 ~0.6초, Ca²⁺ 바인딩 해제의 경우 τ = ~0.2초) 최소 ~8Hz의 프레임 속도가 권장됩니다.
   7. 광 자극 및 기록
      1. sub-stage full-field light stimulator를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
         참고: full-field light stimulator에 대한 간단한 솔루션은 마우스 원뿔의 파장 감도와 일치하지만 동시에 형광 검출에 사용되는 필터와 겹치지 않는 두 개의 대역 통과 필터링 LED(예: "blue": 360 band-pass (BP) 12, "green": 578 BP 10)를 사용하는 것입니다. LED에서 나오는 빛은 레코딩 챔버의 바닥을 통해 콘덴서에 의해 집속됩니다(그림 2).
      2. 레이저를 켜고 광 자극(2.2.3 참조)을 제시하거나 약리제를 적용하기 전에 원뿔이 스캐닝 레이저와 자극 배경 조명(20 - 30초)에 적응하도록 합니다.
      3. 임의의 자극(예: 그림 3B, C와 같이 섬광)의 제시를 시작합니다. 2.2.1단계에서 설명한 자극기의 경우, 맞춤형 소프트웨어로 제어되는 마이크로프로세서 보드를 사용하여 시간이 지남에 따라 두 LED의 강도를 변조하여 자극을 생성합니다.
      4. 두 개의 형광 채널 기록을 시작합니다(예: "파란색"의 경우 483nm에서
   8. Förster 공명 에너지 전달(FRET)-도너 eCFP 및 "황색" FRET-수용체의 경우 535nm에서)를 각각 각각의 이미지 획득 소프트웨어(2.1.6 참조)를 동시에 사용합니다. 예를 들어, 섬광의 경우(그림 3B, C), 최소 8 - 10개의 자극 프레젠테이션(시도)을 기록합니다.

결과

그림 1. 수직 망막 절편의 준비. (가) 절단을 위해 준비된 고립되고 평평한 망막. (나) 절단 후 여과지 멤브레인(짙은 회색)에 장착된 직사각형 망막 조각(A의 빨간색 상자 참조). (씨) 그리스를 사용하여 유리 커버슬립에 고정된 멤브레인 장착 망막 슬라이스의 평면도. (디) 망막 슬라이스 부분의 개략도(C의 빨간색 상자 참조). 원뿔 광...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
고진공 그리스	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
커버 슬립	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
유리 슬라이드	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
티슈 초퍼	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0.25 mm용 블레이드 0.25 mm; http://www.martor.de
티슈 다퍼	맞춤형
니트로셀룰로오스 필터 멤브레인 그리드	머크 밀리포어	AABG01300	필터 유형: 0.8 μm; http://www.emdmillipore.com
UV/녹색 LED 기반 풀필드 자극기	맞춤형 빌드
오픈 소스 마이크로 프로세서 보드	Arduino		http://www.arduino.cc
이미징 소프트웨어 CfNT	맞춤형 작성		Michael Müller, MPI for Medical Research, Heidelberg, Germany가 개발
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 시스템 초점 관류 시스템	ALA 과학 기기		, 100μm 직경 팁 매니폴드가 있음, http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (Ti:Sapphire laser)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Movable objective microscope (MOM), Designed by W. Denk, MPImF, Heidelberg, Germany	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w 대물렌즈	올림푸스		http://www.olympusamerica.com
라이카 MZ95	라이카 마이크로시스템		http://www.leica-microsystems.com/