이 비디오는 빛에 의한 광수용체 손상 후 아가로스가 박힌 제브라피시 망막 이식에서 Muller 신경교세포 핵 이동의 라이브 셀 이미징을 보여줍니다. 손상된 광수용체에 의해 방출된 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 뮐러 신경교세포(Muller glial cell)를 활성화하여 유사분열 및 신경 전구 생성(neuronal progenitor) 생성을 위해 내핵층과 외핵층을 통한 핵 이동을 유발합니다. 캡처된 이미지는 망막 재생 중 핵 이동과 전구 세포 분화의 역학을 보여줍니다.
프로토콜
동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 다광자 현미경
참고: 이 원고에서 수행된 실험은 적외선 레이저(재료 표 참조), 40X Apo 장거리 침수 대물렌즈(N.A. 1.15), 검류계 스캐너 및 4개의 35mm 페트리 접시용 인서트가 포함된 환경 챔버가 장착된 다광자 현미경에 최적화되었습니다. 이미지는 디스캔되지 않은 검출기(R-NDD)로 획득했습니다.
이미징하기 전에 환경 챔버를 평형을 이루어 5% CO2/공기 대기를 달성합니다. 가스가 실내로 누출되지 않도록 빈 페트리 접시가 홀더에 삽입되어 있는지 확인하십시오.
현미경 시스템을 켭니다.
환경 챔버가 평형을 이루면 굴절률 액체를 40X Apo 장거리 침수 대물렌즈(N.A. 1.15)에 추가합니다. 참고: 물과 유사한 광학 특성을 가진 굴절률 액체는 장기 이미징 중 물의 증발을 방지하는 데 사용됩니다.
망막 외식이 있는 형석 접시를 챔버에 놓습니다. 명시야광을 사용하여 표본을 빛의 경로에 배치하고 등쪽 망막의 중간 영역을 초점면으로 가져옵니다.
GFP 에피 형광등을 사용하여 gfap:nGFP 양성 뮐러 신경교핵(그림 1A, C)에 초점을 맞춥니다(그림 1A, C). 참고: 외식이 평평하게 장착되지 않거나 외식초 아래에 아가로스가 쌓인 경우 gfap:nGFP 양성 핵에 초점을 맞추기 어렵거나 희미하게 형광을 발합니다.
동일한 망막 이식 내에서 다른 영역으로 이동하면 초점 문제를 극복할 수 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 다른 망막 이식으로 이동하십시오.
이미지 획득 소프트웨어에서 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Compact GUI' 및 'ND 획득' 창을 엽니다. 다광자 이미징의 경우 'A1 Compact GUI'에서 'IR NDD' 옵션이 선택되어 있는지 확인합니다.
'setting' 필드에서 1st dichroic mirror에 대해 IR-DM을 선택하고 GFP 형광을 얻기 위해 band pass filter 525/50을 선택합니다.
'A1MP GUI'라고 표시된 창에서 IR 레이저를 켭니다. 레이저가 준비되는 데 몇 분 정도 걸립니다. 파장을 910nm로 설정하여 GFP 형광을 여기시키고 'A1 MP GUI' 창에서 '자동 정렬' 버튼을 클릭하여 레이저를 정렬합니다.
광전자 증배관의 과다 노출을 방지하기 위해 'A1 MP GUI'에서 셔터를 열기 전에 실내 및 장비 조명이 꺼져 있거나 덮여 있는지 확인하십시오. 노이즈 수준을 줄이려면 어두운 환경에 현미경을 장착하십시오.
300 x 300 픽셀의 시야각, 2의 줌, 4.8μs/픽셀의 픽셀 체류 시간의 이미지를 획득합니다. 'A1MP GUI'에서 '획득 영역'을 변경하고 'A1 Compact GUI' 창에서 게인을 변경하여 레이저 출력을 대략적으로 설정합니다.
z-stack 설정하기
Focus on the ganglion cell layer (GCL)를 'ND acquisition' window 내의 'z'-subwindow에 있는 z-stack의 상단 초점면을 설정합니다. 일부 gfap:nGFP 양성 세포는 일반적으로 신경절 세포층에 위치하며, 이는 망막의 기저 한계를 확인하는 데 도움이 됩니다(그림 1A, D).
내부 핵층(INL)의 상대에 비해 둥글고 확대된 희미하게 표지된 gfap:nGFP 양성 세포의 존재를 특징으로 하는 외부 핵층(ONL)(그림 1A, B)의 수준을 통해 초점면을 이동합니다(그림 1A, C).
이 평면을 z 스택의 맨 아래로 설정합니다. 전체 ONL이 이미지화되는지 확인합니다(그림 1A, B).
이미징 기간 동안 다시 조정해야 하는 초점면 이동이 발생하면 'z' 하위 창에서 중간 위치를 두 번 클릭하여 '홈' 위치로 할당합니다. '대칭 모드 정의됨'으로 변경하고 '상대'를 클릭합니다.
z-스텝 크기를 0.7에서 1μm 사이로 설정합니다.
Z-intensity correction:
조직의 깊은 층에서 이미징할 때 광 산란으로 인한 픽셀 강도 손실을 보상하기 위해 z-intensity 보정을 적용합니다.
'z-intensity correction' 창에서 하단 초점면(이 경우, 신경절 세포층에 해당)을 클릭하고 레이저 강도('A1MP GUI'의 '획득 영역')와 게인(A1 Compact GUI)을 설정합니다.
'z-intensity correction' 창에서 'z-values' 옆에 있는 화살표를 클릭하여 선택한 초점면에 대한 'z-intensity correction' 창의 'device settings' 아래에 표시되는 설정을 확인합니다.
중간 및 상단 평면에 대해 이 과정을 반복하여 레이저 출력과 게인을 높입니다. 필요한 경우 추가 초점면을 추가할 수 있습니다. 그림 1 - 3의 실험에 대한 특정 레이저 및 게인 설정은 표 1을 참조하십시오.
'A1 MP GUI' 창에서 '획득 영역'을 설정합니다. 광표백과 노이즈 수준 증가를 피하기 위해 이미징 시작 시 15보다 큰 획득 영역과 126보다 높은 게인을 선택하지 마십시오. 참고: 레이저와 광전자 증배관은 현미경 시스템 간에 다르므로 레이저 및 게인 설정을 테스트하여 광표백을 피하면서 현미경 설정에 대한 최적의 이미징 조건을 얻으십시오.
'ND acquisition' 창의 'timeseries' 하위 창에서 지속 시간을 8시간으로 설정하고 간격을 'no delay'로 설정합니다. 그런 다음 'ND acquisition' 창 버튼의 'z-stack' 하위 창에서 'Run z-correction'을 클릭하여 3D 시계열을 획득해야 합니다.
이미지 획득 기간 동안 27 - 29 °C의 온도에서 망막 외출을 유지하십시오.
이미지 획득 기간 동안 필요한 경우 사후 이미징 분석을 위해 이미지 품질을 유지하기 위해 출력 수준과 게인을 다시 조정합니다. 조정을 위해 1.11.2 - 1.11.4 단계를 수행합니다.
초점면이 이동하면 실행을 일시 중지하거나 중지하고 1.11단계를 다시 수행합니다. 참고: 1.12.7단계에서 '상대 z-보정'을 선택하고 1.11.4단계를 수행한 경우 광범위한 광표백이 발생하지 않는 한 전력 및 게인 레벨을 다시 조정할 필요가 없습니다.
표 1: 그림 1 - 3에 표시된 실험을 위해 서로 다른 평면에서 Z-Intensity 보정에 사용되는 레이저 및 게인 레벨.
Tg[gfap:EGFP]nt11
Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
레이저 파워
게인
레이저 파워
게인
상부(간상 광수용체)
13
126
3.5
118
중간(뮬러 신경교세포)
10
126
2.8
118
하부(신경절 세포층)
8
126
2.1
118
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결과
그림 1: 망막 다광자 Z-스택의 3D 재구성. A) 48시간 동안 빛 손상을 입은 후 제브라피시의 망막 전체 마운트 배양에서 gfap:nGFP 양성 세포의 다광자 z-스택 이미지 시리즈의 3D 재구성. B - D) 3D 재구성에서 (A)의 ONL(B), INL(C) 수준에서 표시되는 gfap:...
