형질주입된 1차 마우스 대뇌 피질 세포의 저속 촬영 이미징

초록

출처: Landeira, B. S.,et al., 2D 배양 시스템을 사용한 1차 대뇌 피질 세포의 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2017)

이 비디오는 타임랩스 이미징을 사용하여 형광 표지된 피질 전구 세포를 추적하고, 분열 및 분화를 모니터링하고, 1차 대뇌 피질 세포의 계통 발달을 연구하는 방법을 보여줍니다

프로토콜

1. 타임랩스 비디오 현미경

참고: 이 단계에는 배양 챔버가 있는 도립 형광 현미경이 필요합니다(재료 표 참조).

1. 레트로바이러스 감염 후 조직 배양 플레이트를 온도 및 CO₂ 컨트롤러에 연결된 인큐베이터에 넣습니다.
   참고: 이미징을 시작하기 전에 챔버를 3시간 동안 예열하면 획득 중 드리프트 및 초점 흐림을 최소화하는 데 도움이 될 수 있습니다.
   참고: 챔버는 37°C 및 5% CO₂의 일정한 조건으로 셀을 유지해야 합니다.
2. XY축에서 0점(XY = 0)으로 사용할 위치를 선택합니다. 이렇게 하면 참조가 나중에 위치를 다시 찾을 수 있습니다.
   참고: 영점을 결정하기 위한 참조로 사용할 수 있는 판에 기호를 그리는 것이 좋습니다.
3. 10X 배율로 이미징할 위치를 선택합니다.
   참고: 웰당 10-15개의 위치를 선택하여 후바이러스로 transfection된 세포를 관찰할 가능성을 높입니다.
   참고: 장거리 고배율 대물렌즈(20X 또는 40X)를 사용하여 고해상도 이미지를 얻을 수 있습니다. 대물렌즈의 작동 거리에 따라 유리 바닥 플레이트가 필요할 수 있습니다.
4. 5분마다 위상차 이미지를 획득하고 3시간마다 형광 이미지를 획득하여 광독성을 줄입니다. 온도가 평형을 이루는 동안 변경될 수 있으므로 실험의 처음 3시간 동안 초점을 확인하고 조정하십시오. 매일 초점을 확인하고 조정하십시오.
   참고: 우리는 처음 24시간 후에 초점이 안정되는 것을 관찰합니다. 그러나 초점을 모니터링하는 것이 좋습니다. 또는 소프트웨어 기반 자동 초점 시스템을 사용하십시오.
5. 7일 후에 획득을 중지합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ImageJ	NIH
tTt	ETH 취리히
세포 관측 현미경	Zeiss
The Tracking Tool (tTt) 소프트웨어		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html