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동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.
1. 살아있는 인터뉴런의 형광 염색
1. 광경 유리 절단 파스퇴르 피펫을 사용하여 소뇌 절편을 6웰 플레이트(웰당 최대 3절편)로 옮깁니다. Hanks의 균형 잡힌 염 용액(HBSS) 배지를 흡입합니다.
2. 형광 염료(10μM)의 로딩 용액 5ml에 슬라이스(최대 3개)를 배양합니다.
3. 빛으로부터 보호하려면 마이크로플레이트를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 세포 라벨링을 용이하게 하기 위해 RT에서 10분 동안 35rpm의 자이로 이동 테이블에 놓습니다.
4. Transwell 인서트의 멤브레인에 슬라이스를 전송합니다(3.0μm 기공 크기; 그림 1D) 넓은 구멍 유리로 잘린 파스퇴르 피펫으로. 피펫으로 로딩 매체를 흡입합니다.
5. 삽입물을 제거하고 Dulbecco의 변형된 독수리 매체(DMEM) 1.9ml로 웰을 채웁니다. 삽입물을 교체하고 조직을 덮기 위해 슬라이스 위에 100μl의 DMEM을 추가합니다.
6. 배양 삽입물이 들어있는 플레이트를 인큐베이터 챔버 (37 ° C, 5 % CO2)에 2 시간 동안 놓아 분자 층 (ML)에서 과립 세포 (GC)를 관찰하기에 충분합니다. 삽입 멤브레인에 부착할 수 있도록 조직을 평평하게 놓습니다(그림 1E). 조각이 건조되지 않는지 확인하십시오.
2. 컨포칼 매크로를 통한 생체 외 이미징
1. 플라스틱 뚜껑이 없는 플레이트를 컨포칼 매크로스코프의 스탠드에 부착된 인큐베이터로 옮깁니다. 매크로스코프의 플레이트 삽입물에 유리 덮개를 놓습니다. 챔버의 온도를 37.0 °C ± 0.5 °C로 유지하고 플레이트 인서트를 통해 일정한 가스 흐름(95% O2, 5% CO2)으로 슬라이스를 공급하여 pH 상수를 유지합니다. 타임랩스 실험 전에 추가로 2시간 동안 기다립니다.
2. 조직 절편에서 GC 이동을 시각화하려면 X2 건조 대물렌즈(작동 거리: 39mm, 직경: 58mm, NA = 0.234)가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 매크로스코프를 통해 레이저 다이오드를 사용하여 488nm 파장의 광으로 준비물을 조명하고 500에서 530nm까지 형광 방출을 감지합니다.
1. GC의 움직임을 미세하게 해결하려면 1.5에서 2.0의 추가 광학 줌 계수로 이미지를 획득합니다. 최대 12시간 동안 30분마다 z축을 따라 단일 초점면 또는 최대 10개의 서로 다른 초점면에서 GC 이미지를 수집합니다.
3. 필요한 경우 유리 덮개를 제거하고 10μl 피펫으로 DMEM에 소량(1-10μl)의 생물학적 활성제 또는 억제제를 첨가하여 GC 이동에 미치는 영향을 연구합니다.
3. 셀 추적
1. 동영상이 재생될 때마다 ImageJ의 ecart 유형 모드를 통해 z-stack 프로젝션을 수행합니다. 연속적인 이미지의 대비와 밝기 수준을 조절하여 레이블이 지정된 GC의 식별 및 추적을 용이하게 합니다. 참조 스냅샷의 각 위치를 수동으로 매핑합니다(t = 0에서).
1. Analyse Particle Menu의 "Manual tracking" 플러그인을 사용하여 타임랩스 동안 각 세포체의 중력점을 클릭하여 결정합니다. 원시 추적 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다.
2. ImageJ에서 내보낸 원시 추적 데이터를 각 셀 및 관련 위치를 식별하는 스마트 홈 프로그램으로 재구성합니다. 프로그램을 사용하여 각 셀에 대한 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산합니다. 동일한 프로그램을 사용하여 적절한 필터 하에서 제어 및 처리 조건에서의 세포 이동 특성을 분류하고 비교합니다.
