컨포칼 현미경을 사용한 마우스 신경 줄기 세포 분열의 타임 랩스 이미징

초록

출처: Daynac, M., et. al입니다. 성체 쥐 심실하 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 분류 및 세포 주기 역학의 라이브 이미징. J. Vis. Exp. (2015)

이 비디오는 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 형질전환 마우스 뇌에서 신경 줄기 세포(NSC)의 타임 랩스 이미징을 보여줍니다. NSC는 G1 단계에서 적색 형광을 발하고 다른 세포 주기 단계에서는 형광을 발하지 않습니다. 부착된 NSC 배양물을 이미징 챔버에 배치하고, 이미징 파라미터를 설정하고, 원하는 기간 동안 일정한 간격으로 이미지를 캡처합니다.

프로토콜

1. 배양 및 Videomicroscopy 전 기본 설정

1. 컨포칼 비디오 현미경 검사용 유리 바닥 배양 플레이트 또는 μ 플레이트를 사용합니다. 1 - 5 x 10³ cells/well의 경우 96웰 플레이트를 사용하고 5 x 10³ cells/well 이상의 경우 24웰 플레이트를 사용합니다.
2. 실험을 시작하기 최소 하루 전에 접착성 단층 배양을 위해 멸균 Poly-D-lysine(PDL) 코팅 플레이트를 준비합니다. 충분한 PDL(증류수 또는 dH_2O에 10μg/ml)을 추가하여 각 웰의 바닥을 코팅하고 37°C에서 밤새도록(O/N) 배양합니다. PDL 용액을 제거하고 dH₂O로 세 번 헹구기 전에 층류에서 최소 2시간 동안 후드에서 플레이트를 건조시킵니다. 즉시 사용하지 않을 경우 코팅된 플레이트를 -20 °C에서 보관하십시오.
3. 신경줄기세포(NSC) 기저 배지 및 NSC 증식 보충제를 9:1 비율(재료 표 참조)과 2 μg/ml 헤파린, 20 ng/ml 정제된 인간 재조합 표피 성장 인자(EGF) 및 10 ng/ml 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 2(FGF-2)와 함께 혼합하여 배양 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 배양 배지를 수조에서 37°C로 예열하십시오.
4. 심실하부(SVZ) 해리를 위해 파파인 용액을 준비합니다: 0.2mg/ml L-시스테인, 0.2mg/ml 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 0.01mg/ml DNase I을 함유한 Earl's Balance Salt Solution(EBSS)에 1mg/ml 파파인(15 UI/ml)을 인산염 완충 식염수(PBS) 중 넣습니다. 용액을 0.2μm 필터에 통과시켜 살균합니다. 사용하기 전에 용액을 37°C에서 평형을 이룹니다.
5. 효소 반응을 중단하기 위해 프로테아제 억제제 용액(Ovomucoid)을 준비합니다: dulbecco's modified eagle medium(DMEM):0.7mg/ml 트립신 억제제 II형을 함유하는 F12 배지. 0.2μm 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
6. 뇌를 채취하기 위한 PBS 0.6% 포도당 용액과 세척 단계 및 항체 염색을 위한 PBS 0.15% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 준비합니다.
7. 해부 도구를 준비하십시오 : 가위, 해부 및 묶는 집게, 메스. 70% 에탄올에 담그십시오.

2. 성체 마우스 뇌 및 SVZ 미세해부

1. 수확: 성체 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 마우스(노화 연구를 위해 2-3개월 및/또는 12개월)를 희생하여 적절한 기관 지침에 따라 경추 탈구를 수행합니다.
2. 마우스에 70% 에탄올을 뿌리고 날카로운 가위로 머리를 자릅니다.
3. 두피를 따라 절개하여 두개골을 드러냅니다.
4. 작은 가위를 사용하여 두개골 기저부에서 후각구를 향해 세로 정중선 절단을 수행합니다. 가위 날로 기본 뇌가 손상되지 않도록 하십시오. 구부러진 집게로 두개골의 위쪽 열린 부분을 제거하여 뇌를 노출시킵니다.
5. PBS에 0.6% 포도당이 들어 있는 15mm 페트리 접시에 뇌를 수집합니다.
6. 후각구를 해부합니다. 뇌를 등쪽 표면에 놓고 메스를 사용하여 시신경을 통해 관상 절편을 만듭니다.
7. 해부 현미경 아래에서 절단된 관상 표면이 실험자를 향해 위쪽을 향하도록 뇌 절편의 상부 부분을 배치합니다.
8. SVZ를 절개하려면 미세한 곡선 겸자로 중격을 제거한 다음 미세한 겸자의 한쪽 끝을 심실 바로 옆의 선조체에 삽입하고 주변 조직에서 SVZ를 분리합니다. 해부된 SVZ를 PBS-0.6% 포도당 1ml가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.

3. SVZ 조직 해리:

1. 큰 조각이 남지 않을 때까지 페트리 접시에서 절개된 SVZ를 다집니다.
2. 다진 조직을 PBS-0.6% 포도당과 함께 15ml 튜브에 옮기고 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 상등액을 버리고 0.01mg/ml DNase I.이 보충된 예열 파파인 1ml(1mg/ml, 1.4단계에서 준비)를 추가합니다. 37°C의 수조에서 10분 동안 배양합니다. 마우스당 파파인 1ml를 사용합니다.
4. 200 x g에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
5. 예열 된 오보뮤코이드 1ml(0.7mg/ml, 1.5단계에서 준비)를 추가하여 파파인 활성을 중지합니다. p1000 마이크로피펫 팁을 통해 위아래로 20회 부드럽게 피펫팅하여 다진 조직을 단일 세포 현탁액으로 기계적으로 더 해리합니다. 기포를 피하십시오.
6. 새 15ml 튜브에 있는 멸균 20μm 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시킵니다. 세포 손실을 방지하기 위해 셀 필터를 PBS 0.15% BSA로 세척하십시오.
7. 200 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. 0.15% BSA를 함유한 100μl의 PBS에 세포를 재현탁합니다.

4. 세포 분류를 위한 면역형광 염색

FUCCI-Red 마우스(그림 1A)를 사용한 세포 분류의 경우 다음 항체를 사용하십시오: CD24 phycoerythrin-cyanine7 conjugate [PC7]; CD15/LeX 플루오레세인 이소티오시아네이트[FITC] 접합 및 Ax647 접합 EGF 리간드.

참고: LeX⁺EGFR⁺ 세포와 ^EGFR+ 세포는 성인 SVZ에는 풍부하지 않습니다: 각각 마우스당 600 및 1500 세포 ≈. 충분한 물질을 확보하기 위해 2-3 마우스의 SVZ 세포를 풀링하는 것이 좋습니다. 세포 분류 시간이 3시간을 초과하지 않도록 같은 날에 12마리 이상의 마우스로 작업하지 마십시오. 같은 날에 너무 많은 마우스를 사용하여 작업하면 세포 분류 시간이 증가하여 세포 사멸 및/또는 세포 분화가 증가할 수 있습니다.

1. 마우스당 100μl의 PBS 0.15% BSA에서 FACS 염색을 수행합니다(또는 최적의 염색을 위해 2-3마리의 마우스 그룹의 경우 200μl).
2. 제어 튜브를 준비합니다. 보상 비드를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단색 제어 튜브를 준비하십시오. 세포의 일부(마우스 1마리에서 추출한 세포의 1/10이면 충분)를 선택하고 4개의 튜브로 분리하여 1개의 음성 대조관(표시되지 않은 세포)과 3개의 형광 마이너스 1(FMO) 대조관을 준비합니다. 튜브당 200μl의 PBS 0.15% BSA에 세포를 재현탁합니다.
   힌트: LeX-FITC FMO 대조군의 경우 CD24-PC7(1:50) 및 Ax647-conjugated EGF ligand(1:200)로 세포를 라벨링합니다. CD24-PC7 FMO 대조군의 경우 CD15/LeX-FITC (1:50) 및 Ax647-conjugated EGF ligand (1:200)로 세포를 라벨링하고, Ax647-conjugated EGF ligand FMO control의 경우 CD15/LeX-FITC (1:50) 및 CD24-PC7 (1:50)로 세포를 label합니다.
3. 세포 분류에 사용되는 튜브의 경우 PBS 0.15% BSA에 표시된 희석으로 CD24-PC7 (1:50), CD15/LeX-FITC (1:50) 및 Ax647-conjugated EGF ligand (1:200) 항체를 사용합니다.
4. 어두운 곳에서 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오. 1 ml PBS 0.15% BSA로 세척하고 200 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 뇌당 200μl의 PBS 0.15% BSA에 세포를 재현탁합니다. 세포 분류 튜브를 얼음 위에 올려놓고 즉시 세포 분류를 진행하십시오.
5. FUCCI-Green 마우스를 사용하는 경우, LeX-FITC 항체가 FUCCI-green 형광과 동일한 방출 파장을 공유하므로 세포 분류 전에 분리 컬럼을 사용하여 LeX-positive 및 LeX-negative fraction을 분리합니다(그림 2A, B).
   1. 먼저, PBS 0.15% BSA 100μl의 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 마우스 anti-human LeX-antibody(1:50)로 세포에 라벨을 붙입니다.
   2. 1ml PBS 0.15% BSA와 원심분리로 200 x g에서 10분 동안 세포를 세척한 다음 어둠 속에서 4°C에서 15분 동안 anti-mouse IgM 마이크로비드(1:10)로 세포를 라벨링합니다.
   3. 1ml PBS 0.15% BSA로 세포를 세척하고 200 x g에서 10분 동안 원심분리합니다. 500μl PBS 0.15% BSA에 세포를 재현탁하고 그림 2C에 개략화된 대로 자기장의 분리 컬럼을 통해 세포를 붓습니다. 1ml PBS 0.15% BSA로 컬럼을 세척하여 LeX 음성 분획을 얻습니다.
   4. LeX 양성 분획을 얻으려면 자기장에서 분리 컬럼을 제거하고 2ml PBS 0.15% BSA로 세포를 용리합니다.
   5. 4.2에 표시된 대로 CD24-PC7 및 Ax647-conjugated EGF ligand staining을 진행합니다.

5. 세포 분류

참고: 세포는 86μm 노즐을 사용하여 40Psi에서 FACS 분류기에서 분류되었습니다. 520/35nm(FITC), 575/26nm(PE), 670/20nm(Ax647) 및 740LP(PC7) 필터 세트를 사용하여 형광을 수집했습니다. FUCCI-red 형광과 PC7 염료의 방출 스펙트럼 사이에 중복이 발견되므로 거짓 양성 신호를 방지하기 위해 보상이 필요합니다.

1. 세포 분류 직전에 살아 있는 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 바이탈 염료를 첨가합니다. 우리는 Hoechst(HO)(재료 표 참조)를 2μg/ml 최종 농도에서 사용했습니다. FACS 분류기를 통해 negative control tube(표시되지 않은 cells)를 실행하고 side scatter(SSC) 및 forward scatter(FSC) 매개변수를 사용하여 셀을 선택합니다(그림 3A).
   참고: dead cell은 HO-negative fraction(그림 3A)만 게이팅하여 제외한 다음 Pulse Width negative fraction(그림 3A)을 선택하여 doublet을 제외했습니다.
2. 4.2단계에서 준비한 단일 색상 컨트롤을 실행하고 필요한 경우 PMT(PhotoMultiplier Tube) 전압을 조정합니다(예: 음수 모집단이 너무 높거나 스케일에서 벗어난 양수 셀). 소프트웨어의 보정 창에서 색상 보정을 수행합니다.
3. 4.2단계에서 준비한 FMO 제어(LeX-FITC FMO 제어, CD24-PC7 FMO 제어, Ax647 복합 EGF 리간드 FMO 제어)를 실행하고 정렬 게이트를 그립니다(그림 3). 세포를 1.5ml 마이크로튜브에 담긴 100μl의 배양 배지로 직접 분류합니다.

6. 현미경 검사용 세포 준비

:

1. 300μl의 배양 배지가 있는 Poly-D-Lysine-코팅된 96-well μ-Plate에서 1 - 3 x 10³ cells/well의 밀도로 갓 분류된 세포를 플레이트
화합니다.
2. 비디오 현미경 검사 전에 세포 부착을 위해 최소 1시간 동안 37°C 및 5% CO₂에서 배양 플레이트를 배양합니다.

7. 현미경 설정 및 이미지 획득

1. 5% CO₂ 대기에서 37°C의 도립 온도 조절 챔버에 부착된 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경 시스템에서 Plan Apo VC 20x DIC 대물렌즈(NA: 0.75)를 사용하여 라이브 이미징을 수행합니다.
2. 96웰 μ-플레이트를 예열 및 평형화된 온도 조절 챔버 내부에 배치하고 뚜껑을 온도 조절 덮개로 교체합니다.
3. NIS-Elements 소프트웨어를 열고 "획득/획득 제어/ND 획득"의 메뉴 표시줄을 클릭하여 타임랩스 옵션(길이, 스테이지 위치, 공초점 z-섹션,...)을 선택하고, "획득/획득 제어/Ti Pad"를 클릭하여 목표를 선택하고, "획득/획득 제어/A1plus 설정"을 클릭하여 메뉴 표시줄에서 각 형광에 대한 PMT 수준을 선택합니다. 데이터 파일을 저장할 폴더를 선택합니다.
4. ND 획득 창을 사용하여 각 웰의 중심을 스테이지 위치로 설정하고 큰 이미지 옵션을 7 x 7 mm²로 선택합니다. 이렇게 하면 각 우물의 중심 주위에 모자이크 이미지가 생성됩니다. 큰 모자이크 이미지의 겹침을 5%로 설정합니다. 24시간 동안 20분마다 사진을 찍습니다. Ti Pad 창에서 Plan Apo VC 20x DIC 대물렌즈(NA: 0.75)를 선택합니다.
5. A1plus 설정 창에서 1.26μm/픽셀의 해상도로 512 x 512 픽셀 형식의 고속 공진 스캐너를 사용하여 이미지를 획득합니다. 명시야를 사용하여 셀 모양을 시각화합니다. FUCCI-Red 마우스의 경우 561nm에서 적색 형광을 여기하고 595/50nm 필터를 사용하여 수집합니다. FUCCI-Green 마우스의 경우 488nm에서 녹색 형광을 여기하고 530/40nm 필터를 사용하여 수집합니다. 각 파장에 대한 최적의 PMT 레벨, 오프셋 및 레이저 출력을 결정합니다.
   참고: 명시야 채널에 자동 초점 기능을 사용하여 소프트웨어가 각 획득 전에 각 스테이지 위치에서 자동 초점을 맞출 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 힌트: Plan Apo VC 20x DIC 대물렌즈(NA: 0.75)는 오일이 필요 없는 뛰어난 해상도를 위해 사용되었습니다. 원하는 광학 해상도에 따라 다른 대물렌즈를 사용할 수 있습니다.
6. ND 수집 창에서 'Run now' 버튼을 선택하여 수집을 시작합니다.

결과

그림 1: FUCCI-Red 마우스를 사용한 세포 주기의 실시간 분석.(A) G 동안 세포가 적색 형광을 발하는 FUCCI-Red 세포 주기의 개략적 표현₁ 상 및 S-G₂ / M 상 동안 무색. (B) SVZ 세포에서 FUCCI-Red 형광의 FACS 표현. (C, D) 젊은(C) 및 중년(D) FUCCI-Red 마우스에서 분류된 LeX⁺EGFR⁺ ...

재료