Visualization of a Mouse Brain Choroid Plexus Using Scanning Electron Microscopy(주사 전자 현미경을 사용한 마우스 뇌 맥락막 신경총의 시각화)

초록

출처: Van Wonterghem, E., et al. Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy Visualization of Mouse Choroid Plexus(쥐 맥락막 신경총의 Microdissection and Whole Mount Scanning Electron Microscopy) 시각화. J. Vis. Exp. (2022)

이 비디오는 주사전자현미경(SEM)을 사용하여 마우스 뇌에서 맥락막 신경총 조직을 준비하고 이미징하는 방법을 보여줍니다. 이 공정에는 조직 고정, 탈수 및 전도성 백금 층으로 코팅하여 이미징을 위해 샘플을 안정화하고 준비하는 것이 포함됩니다. SEM은 미세융모로 상피 세포의 상세한 이미지를 캡처하여 조직의 구조적 특징에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

동물 샘플과 관련된 모든 절차는 해당 동물 윤리 검토 위원회에서 검토되고 승인되었습니다.

1. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 맥락막신경총(CP) 조직의 형태학적 분석

주의: 독성 용액은 다음 처리 단계에서 사용됩니다. 흄 후드에서 샘플 준비를 수행하는 것이 좋습니다.

1. 아래 설명된 대로 SEM에 대한 샘플 준비를 수행합니다.
   1. 새로 분리된 CP를 0.1M Na-cacodylate buffer(pH 7.4)에 2% 파라포름알데히드와 2.5% 글루타르알데히드를 함유한 새로 만든 고정 용액으로 옮깁니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      참고: CP 조직은 매우 연약하고 얇기 때문에 조직을 작은 표본 바구니(재료 표 참조)에 넣어 완충액 간에 이동시켜야 합니다. 이런 식으로 조직의 구조가 더 잘 보존됩니다. 강력한 카코딜레이트 완충액이 EM 고정제의 낮은 pH에 대응할 수 있기 때문에 인산염 완충 식염수(PBS) 기반 고정제보다 카코딜레이트 기반 고정제가 사용됩니다.
   2. 3-5mL의 0.1M Na-cacodylate 완충액(pH 7.4)으로 샘플을 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
   3. 0.1M Na-cacodylate buffer에 3-5mL의 2% osmium tetroxide에 있는 샘플을 30분 동안 사후 고정합니다. 초순수 3-5mL로 샘플을 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
   4. 에탄올(EtOH) 농도가 (50%, 70%, 85%, 100%) 증가하는 일련의 얼음처럼 차가운 용액에서 EtOH 용액당 15분 동안 샘플을 탈수합니다. 임계점 건조기를 사용하여 샘플을 적절하게 포인트 건조합니다. 참고: 액체 상태에서 기체 상태로 변화하면 표면 장력에 영향을 주어 표면 구조에 손상을 입힙니다. 임계점 건조 단계는 표면 구조를 보존할 수 있습니다.
   5. 탄소 스티커가 있는 시편 마운트에 샘플을 조심스럽게 놓습니다(재료 표 참조).
   6. 샘플을 백금의 얇은 층(2-5nm)으로 코팅합니다. 이렇게 하려면 두 개의 고전류 전기 단자 사이의 진공 시스템에 백금 소스를 장착하고 백금을 증발 온도까지 가열합니다. 백금의 미세한 흐름이 샘플에 증착됩니다. 참고: 백금 외에도 금 또는 금/팔라듐도 사용할 수 있습니다.
2. SEM으로 CP 샘플을 시각화합니다(재료 표 참조). SEM을 통한 CP 조직의 시각화 절차는 다른 유형의 조직과 유사하며 사용되는 소프트웨어와 도구에 따라 다릅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
알루미늄 시편 마운트	EM Sciences	75220
카코딜레이트 버퍼	EM Sciences	11652
탄소 접착 탭 -12 mm	EM Sciences	77825-12
임계점 건조기	Bal-Tec	CPD030
크로스빔 540	Zeiss		SEM 시스템
겸	Fine Science Tools GmbH	91197-00
글루타르알데히드	EM Sciences	16220
오스뮴 테트록사이드	EM Sciences	19170
파라포름알데히드	Sigma-Aldrich	P6148
인산염 완충 식염수(PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS without Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ 또는 phenol red; sterile
filtered Specimen Basket Stainless Steel	EM Sciences	70190-01

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