이 비디오는 유전적으로 암호화된 칼슘 바이오센서를 발현하는 ALS 돌연변이 뉴런의 시냅스 활동을 모니터링하기 위한 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다. 뉴런 시냅스 활동을 반영하는 세포 내 칼슘 수치의 실시간 변화를 측정하기 위해 이미징, 칼슘 역학 자극 및 형광 기록을 위해 뉴런을 준비하는 단계를 간략하게 설명합니다.
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방법 논문
Fluorescence Imaging of Synaptic Calcium Dynamics in an In Vitro Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis(근위축성 측삭 경화증의 시험관 내 모델에서의 시냅스 칼슘 역학의 형광 이미징)
1.1K 조회수
⸱
2025년 6월 17일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. Gcamp6m 칼슘 과도 현상의 형광 이미징
- 500ng의 Gcamp6m.
로 35mm 유리 바닥 접시에서 배양된 1차 설치류 피질 뉴런을 Transfection: 원하는 경우 적색 또는 원적외선 범위의 형광 태그를 포함하는 관심 플라스미드와 함께 형광 뉴런을 형광 트랜스펙 션합니다. - 저염화칼륨(KCl) 인공 뇌척수액(aCSF)(표 1)이 낮은 뉴런을 transfection 후 15분, 48시간 동안 배양한 다음 이미징 플랫폼에 접시를 장착합니다.
- FITC(fluorescein isothiocyanate) 필터(488nm)와 20x 또는 40x 대물렌즈를 사용하여 GCaMP6m 형광을 시각화합니다.
- 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춥니다. 다음으로, 명시야, FITC 및 형광 마커 채널이 있는 단일 스틸 이미지를 촬영하여 뉴런 경계를 표시합니다.
- 획득 소프트웨어에서 지금 실행을 시작합니다. 5분 동안 기준선 기록을 수행한 다음 50mM KCL을 포함하는 aCSF로 관류합니다(표 1).
참고: 이 이미징의 목표는 유발된 칼슘 과도 현상을 측정하는 것입니다. 뉴런이 자극 전 기간 동안 기초 발화 활동과 칼슘 플럭스를 갖는 경우, 데이터 분석에 사용되지 않습니다. 대신, 안정적인 배경 형광을 가진 세포만 사용됩니다. 자극 후 기간은 칼슘 과도 상태의 경우 60분까지 연장될 수 있으며, 추가적인 지속적인 높은 KCl 관류 유무에 관계없습니다. - 실험을 저장하고 컨포칼 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 이 시점에서 실험을 중단할 수 있으며 나중에 분석을 수행할 수 있습니다.
참고: 세포가 관심 단백질의 발현을 위해 transfection을 필요로 하지 않는 경우, 칼슘 과도 현상을 검사하려고 할 때 in vitro 시점 중 언제든지 이 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 칼슘 과도 현상의 측정을 보장하기 위해 대조 세포를 테스트한 후, 실험자는 편향을 최소화하기 위해 테스트된 각 요리의 유전적 또는 약리학적 상태에 대해 맹검해야 합니다.
2. 이미지 분석
:- 컨포칼 소프트웨어로 타임랩스 이미지를 엽니다.
- 명령 시리즈로 타임랩스 시리즈의 이미지 정렬: Image | 처리 | 현재 문서를 정렬합니다. 첫 번째 프레임에 정렬을 선택합니다.
- 이미지 프레임 오른쪽에 있는 콩 모양의 아이콘인 ROI 선택 도구를 사용하여 신경돌기를 따라 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 또한 배경 형광 강도를 나타내는 ROI를 표시합니다.
참고: ROI는 명시야 정지 이미지로 표시된 뉴런 트랙을 따라 뚜렷하게 분리된 반점 영역을 선택하여 선택합니다. 분석을 위해 뉴런당 최소 5개의 ROI가 선택됩니다. 배경 ROI는 신경돌기를 포함하지 않는 시야의 영역에서 선택됩니다. - 다음 명령 시리즈를 사용하여 선택한 ROI에 대한 시간 경과에 따른 원시 형광을 측정합니다. 시간 측정.
- 시간 측정 패널의 상단에서 측정 기능을 시작합니다. 시간 경과에 따른 원시 형광의 그래픽 표현과 정량적 데이터가 모두 생성됩니다.
참고: 각 데이터 포인트는 측정된 특정 시점과 관련된 프레임에 대한 해당 ROI에 대한 원시 형광을 나타냅니다.
- 시간 측정 패널의 상단에서 측정 기능을 시작합니다. 시간 경과에 따른 원시 형광의 그래픽 표현과 정량적 데이터가 모두 생성됩니다.
- 원시 형광 강도를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.
표 1: 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액의 조성.
| 낮은 KCL aCSF 완충액(pH 7.40 to 7.45) | |
| 시약 | 농도 |
| HEPES | 10 mM |
| NaCl | 140 mM |
| KCl | 5 mM |
| 포도당 | 10 mM |
| CaCl: 2, 2H, 2, O | 2 mM, |
| MgCl2, 4H2O | 1 mM, |
| 높은 KCL, aCSF 완충액 (pH : 7.40-7.45) | |
| 시약 | 농도 |
| : HEPES | : 10 mM |
| NaCl | 95 mM |
| KCl, | 50 mM |
| 포도당 | 10 mM |
| CaCl2 2H2O | 2 mM |
| 마그네슘2 4H2O | 1 mM |
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재료
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| 생물안전성 세포 배양 후드 | Baker | SterilGARD III SG403A | Asceptic cell culturing, transfection, and dye loading |
| Beta-mercaptoethanol | Millipore Sigma | M3148 | 신경 세포 배양 및 유지용 |
| 소 혈청 알부민 | Millipore Sigma | A9418 | 신경 세포 배양 준비용 |
| 염화칼슘 이수화물 | Millipore Sigma | 223506 | aCSF 용액의 구성 요소 |
| 세포 배양 이산화탄소 인큐베이터 | Thermo Scientific | 13-998-123 | 및 유지 관리용 |
| 컨포칼 현미경 | Nikon | Eclipse Ti +A1R 코어 | 형광 이미징용 |
| CoolSNAP ES2 CCD 카메라 | 광도측정 | 이미지 획득용 | |
| D-Glucose | Millipore Sigma | G8270 | aCSF 솔루션의 구성 요소 |
| FITC 필터 큐브 | Nikon | 77032509 | 이미징용 Gcamp 칼슘 과도 현상 |
| 유리 바닥 페트리 접시(두께 #1.5) | CellVis | D35-10-1.5-N | 이미징 호환 배양 접시 |
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