Fluorescence Imaging of Synaptic Calcium Dynamics in an In Vitro Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis(근위축성 측삭 경화증의 시험관 내 모델에서의 시냅스 칼슘 역학의 형광 이미징)

초록

출처: Krishnamurthy, K. et al. Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 유전적으로 암호화된 칼슘 바이오센서를 발현하는 ALS 돌연변이 뉴런의 시냅스 활동을 모니터링하기 위한 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다. 뉴런 시냅스 활동을 반영하는 세포 내 칼슘 수치의 실시간 변화를 측정하기 위해 이미징, 칼슘 역학 자극 및 형광 기록을 위해 뉴런을 준비하는 단계를 간략하게 설명합니다.

프로토콜

1. Gcamp6m 칼슘 과도 현상의 형광 이미징

1. 500ng의 Gcamp6m.
   로 35mm 유리 바닥 접시에서 배양된 1차 설치류 피질 뉴런을 Transfection: 원하는 경우 적색 또는 원적외선 범위의 형광 태그를 포함하는 관심 플라스미드와 함께 형광 뉴런을 형광 트랜스펙
션합니다.
2. 저염화칼륨(KCl) 인공 뇌척수액(aCSF)(표 1)이 낮은 뉴런을 transfection 후 15분, 48시간 동안 배양한 다음 이미징 플랫폼에 접시를 장착합니다.
3. FITC(fluorescein isothiocyanate) 필터(488nm)와 20x 또는 40x 대물렌즈를 사용하여 GCaMP6m 형광을 시각화합니다.
4. 이미징 필드를 선택하고 완벽한 초점을 맞춥니다. 다음으로, 명시야, FITC 및 형광 마커 채널이 있는 단일 스틸 이미지를 촬영하여 뉴런 경계를 표시합니다.
5. 획득 소프트웨어에서 지금 실행을 시작합니다. 5분 동안 기준선 기록을 수행한 다음 50mM KCL을 포함하는 aCSF로 관류합니다(표 1).
   참고: 이 이미징의 목표는 유발된 칼슘 과도 현상을 측정하는 것입니다. 뉴런이 자극 전 기간 동안 기초 발화 활동과 칼슘 플럭스를 갖는 경우, 데이터 분석에 사용되지 않습니다. 대신, 안정적인 배경 형광을 가진 세포만 사용됩니다. 자극 후 기간은 칼슘 과도 상태의 경우 60분까지 연장될 수 있으며, 추가적인 지속적인 높은 KCl 관류 유무에 관계없습니다.
6. 실험을 저장하고 컨포칼 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 이 시점에서 실험을 중단할 수 있으며 나중에 분석을 수행할 수 있습니다.
   참고: 세포가 관심 단백질의 발현을 위해 transfection을 필요로 하지 않는 경우, 칼슘 과도 현상을 검사하려고 할 때 in vitro 시점 중 언제든지 이 프로토콜을 수행할 수 있습니다. 칼슘 과도 현상의 측정을 보장하기 위해 대조 세포를 테스트한 후, 실험자는 편향을 최소화하기 위해 테스트된 각 요리의 유전적 또는 약리학적 상태에 대해 맹검해야 합니다.

2. 이미지 분석

:

1. 컨포칼 소프트웨어로 타임랩스 이미지를 엽니다.
2. 명령 시리즈로 타임랩스 시리즈의 이미지 정렬: Image | 처리 | 현재 문서를 정렬합니다. 첫 번째 프레임에 정렬을 선택합니다.
3. 이미지 프레임 오른쪽에 있는 콩 모양의 아이콘인 ROI 선택 도구를 사용하여 신경돌기를 따라 관심 영역(ROI)을 선택합니다. 또한 배경 형광 강도를 나타내는 ROI를 표시합니다.
   참고: ROI는 명시야 정지 이미지로 표시된 뉴런 트랙을 따라 뚜렷하게 분리된 반점 영역을 선택하여 선택합니다. 분석을 위해 뉴런당 최소 5개의 ROI가 선택됩니다. 배경 ROI는 신경돌기를 포함하지 않는 시야의 영역에서 선택됩니다.
4. 다음 명령 시리즈를 사용하여 선택한 ROI에 대한 시간 경과에 따른 원시 형광을 측정합니다. 시간 측정.
   1. 시간 측정 패널의 상단에서 측정 기능을 시작합니다. 시간 경과에 따른 원시 형광의 그래픽 표현과 정량적 데이터가 모두 생성됩니다.
      참고: 각 데이터 포인트는 측정된 특정 시점과 관련된 프레임에 대한 해당 ROI에 대한 원시 형광을 나타냅니다.
5. 원시 형광 강도를 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.

표 1: 인공 뇌척수액(aCSF) 완충액의 조성.

낮은 KCL aCSF 완충액(pH 7.40 to 7.45)
시약	농도
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
포도당	10 mM
CaCl: 2, 2H, 2, O	2 mM,
MgCl2, 4H2O	1 mM,
높은 KCL, aCSF 완충액 (pH : 7.40-7.45)
시약	농도
: HEPES	: 10 mM
NaCl	95 mM
KCl,	50 mM
포도당	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
마그네슘2 4H2O	1 mM

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재료