마우스 모델의 신경 활동과 연결성을 연구하기 위한 이광자 홀로그램 현미경 검사

초록

출처: Kato, D. et. al., Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy(이광자 홀로그램 현미경을 사용한 신경 활동의 평가 및 조작). J. Vis. Exp. (2022)

이 비디오는 홀로그램 현미경을 사용하여 광유전학과 결합된 이광자 이미징 기술을 보여줍니다. 공간 광 변조기를 사용하는 이 기술은 최소한의 광손상으로 적색광에 민감한 단백질과 칼슘 이미징을 표현하는 정밀한 신경 자극을 가능하게 합니다. 이 접근 방식은 신경망의 기능적 연결성 및 구성에 대한 통찰력을 제공합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 헤드 플레이트 이식(그림 1A)

1. 마취제(74mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진의 혼합물)를 복강내로 투여하여 마우스를 마취합니다. 페달 반사를 평가하여 마우스의 마취 상태를 자주 확인하십시오.
2. 마취 후 마우스를 입위 기구에 넣습니다. 헤드 플레이트를 이식할 때 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 눈 연고(재료 표 참조)를 바르십시오.
3. 포비돈-요오드 또는 클로르헥시딘 스크럽을 3회씩 번갈아 가며 사용한 후 70% 알코올 물티슈로 수술 부위를 면도하고 피부를 소독합니다. 두개골을 조심스럽게 노출시키고 면봉으로 닦으십시오.
   참고: 모든 수술 기구는 멸균되어야 하며 그에 따라 모든 절차를 수행해야 합니다. 남아 있는 파편(예: 머리카락 또는 마른 혈액)은 염증 반응을 일으킵니다. 따라서 멸균수 또는 70% 알코올에 적신 면봉을 사용하여 입체경 아래의 이물질을 제거해야 합니다.
4. 정위 좌표(bregma에서 전방 및 후방 = 0.5mm, 내측 및 외측 = 1.5mm)를 사용하여 개두술의 중심을 찾고 마커 펜으로 레이블을 지정합니다.
5. 두개골 중앙에 맞춤형 헤드 플레이트를 놓습니다. 다음으로, 치과용 시멘트(재료 표 참조)를 바르고 두개골에 단단히 고정합니다. 헤드 플레이트가 두개골의 앞면과 뒷면에 단단히 닿을 때까지 가벼운 압력을 가합니다.
   참고: 이 단계는 완료하는 데 약 20분이 소요되며 이광자 이미징 중 뇌의 운동 아티팩트를 줄이는 데 중요합니다. 헤드 플레이트의 치수는 20mm × 40mm × 1mm이며 한쪽 모서리는 15mm 길이, 인접한 두 면 3mm 길이, 나머지 두 면 길이는 10mm입니다.
6. 아크릴 기반 치과용 접착 수지 시멘트를 다음과 같이 혼합합니다: 분말 반 스푼, 액체 3방울, 촉매 1방울(재료 표 참조). 건조를 방지하기 위해 이 혼합 치과용 접착 수지 시멘트를 헤드 플레이트로 마우스의 손상되지 않은 두개골 표면에 바르십시오.
7. 마취에서 회복될 때까지 마우스를 따뜻한 케이지에 넣습니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.

2. 수술 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 주사(그림 1B)

1. 두판 이식 1일 후 두개골에서 치과용 접착 수지 시멘트를 제거하지 않고 개두술 또는 바이러스 주사를 수행합니다.
   참고: 이 절차 중에 마우스에 마취제(74mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진의 혼합물)를 복강내로 투여합니다.
2. 뇌부종을 예방하기 위해 수술 1시간 전에 덱사메타손 인산나트륨(1.32mg/kg)을 복강내로 투여합니다.
3. 발열 패드로 체온을 유지하면서 기화기(마취 전달 시스템)를 사용하여 1% 이소플루란 마취가 있는 헤드 플레이트로 마우스를 마취합니다. 각막이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안연고를 바르십시오.
4. 입체경 아래에서 치과용 드릴을 사용하여 직경 약 2mm의 원형 개두술을 수행합니다. 뇌 손상을 줄이려면 치과 드릴을 지속적으로 약간의 움직임과 가벼운 하향 압력으로 조심스럽게 작동하십시오.
5. 흡입 시스템을 사용하여 뼈 조각을 여러 번 제거합니다. 뼈 조각을 제거한 후 인공 척수액(ACSF) 용액을 사용하여 뇌 표면에 남아 있는 잔여물을 제거하고 씻어냅니다. 염증 반응을 억제하기 위해 이 세척 절차를 여러 번 반복합니다.
   참고: ACSF 용액(140mM 염화나트륨, NaCl, 2.5mM 염화칼륨, KCl, 5mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, HEPES, 2.0mM 염화칼슘, CaCl₂ 및 1.0mM 염화마그네슘, MgCl₂)을 시약을 용해하고 여과한 후 1개월 동안 4°C에서 보관했습니다(공극 크기 = 0.22μm).
6. 압력 주입 시스템(재료 표 참조)을 사용하여 적절한 압력(4ms 지속 시간의 펄스에서 약 10PSI)을 설정하여 팁 직경이 10-20μm(마이크로피펫 풀러로 준비)인 유리 모세관을 통해 500nL의 AAV 용액을 10분 동안 주입합니다.
7. 유리 모세혈관 내 AAV 용액의 수치가 점차 감소하는지 확인하여 AAV 용액이 뇌에 투여되고 있는지 확인합니다.
8. 역류를 방지하기 위해 유리 모세관을 10분 더 제자리에 두십시오. 총 1.5μL의 AAV 용액을 뇌에 투여하기 위해 3회 반복합니다.
9. 레이어 2/3 (L2/3) 피라미드 세포에서 신경 활성을 평가하고 조작하려면 AAV 용액을 주입합니다(Ca²⁺ 이미징의 경우: 1.28 × 10¹⁴ 벡터 게놈/mL에서 AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE, 식염수에 1:1로 희석됨, 광유전학을 사용한 Ca²⁺ 이미징의 경우: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE 1.73 × 10¹⁴ 벡터 게놈/mL, 식염수로 1:1 희석)을 야생형 마우스의 1차 체성 감각 피질의 뒷발 영역(S1, 브레그마에서 0.5mm 후방 및 1.5mm 측면에 중심, 표면에서 150μm 깊이).
   참고: AAV 용액은 jGCaMP8f 및 GCaMP6m-P2A-ChRmine 발현을 이미징하기 2-3주 및 1-2주 전에 주입해야 합니다. 각각.
10. 마이크로피펫을 사용하여 S1의 뇌 표면에 2%(w/v)의 저융점 아가로스를 도포한 후, 두 개의 커버 안경으로 개두술 위에 유리창을 놓습니다. 두 개의 커버 유리(직경 2.0mm의 작은 유리와 4.5mm의 큰 지름, 재료 표 참조)를 자외선(UV) 경화 접착제로 부착합니다.
11. 덮개 유리가 아직 액체인 동안 아가로스에 대고 누르십시오. 이렇게 하면 아가로스에 기포가 형성되는 것을 방지할 수 있습니다. 두개골 창의 가장자리를 치과 및 접착 수지 시멘트로 밀봉합니다(그림 1C).
12. 입체 기기에서 마우스를 제거하고 케이지로 되돌립니다. 마우스를 따뜻한 케이지에 넣고 마취에서 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 케이지로 돌아가지 마십시오. 생존 수술 중 멸균 상태를 조심스럽게 유지하십시오.
13. 수술 후 첫 72시간 동안은 일반적인 행동을 관찰하여 마우스의 건강 상태를 확인하십시오. 일반적인 행동에 이상이 있는 경우에는 항염증제, 진통제를 피하로 주사합니다.

3. 홀로그램 자극 또는 조명 시스템 준비(그림 2)

샘플

1. 평면에 적색 형광 슬라이드(주조 아크릴 기판)의 표면을 배치하여 홀로그램 자극 시스템을 보정합니다. 약한 여기광이 있는 라이브 이미징 모드로 현미경을 놓고 calibration_GUI.m 파일을 실행합니다. 매개변수 창을 확인하고 저장 버튼을 클릭합니다.
2. 1단계 창에서 Z 스캔 버튼을 클릭합니다. 각 평면에서 2μm 떨어진 21개의 축 평면 모두에 3개의 임의 스폿을 자동으로 생성합니다.
3. 슬라이드 바를 이동하여 라이브 이미지를 확인합니다. 반점이 가장 작고 가장 밝게 나타나는 완벽한 평면을 찾은 다음 저장 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 디지털 홀로그램에 대한 오프셋 구형 웨이브프론트가 자동으로 생성됩니다.
   참고: 가장 밝은 형광 스폿을 찾지 못하면 스캔 범위의 최소값과 최대값을 변경하고 다시 시도하십시오.
4. 2단계 창에서 이동 단추를 클릭한 다음 왼쪽 사각형에서 6개의 지점을 클릭합니다. 라이브 이미지를 확인합니다. 구별 가능한 형광 반점이 6개 있는 경우 편집 상자에 x축과 y축을 입력하고 Save 버튼을 클릭합니다. 이렇게 하면 아핀 변환 계수가 자동으로 생성되어 홀로그램 자극과 이미징 시스템 간의 보정을 조정합니다.
   참고: 축 쌍 번호와 클릭된 스폿 번호는 순서대로 일치해야 합니다. 확실하지 않거나 이미지에 스팟이 없는 경우 다시 시도하여 고유한 스폿 패턴을 생성하거나 시야(FOV) 중앙 주위의 더 작은 범위를 선택하십시오.
5. 3단계 창에서 스캔 버튼을 클릭합니다. 441개의 디지털 홀로그램을 생성하여 21단계 × 21단계로 FOV 전체에서 단일 스폿 스캔을 수행합니다.
   1. 먼저 목록 상자에서 패턴을 변경하면서 이미지를 확인합니다. 그런 다음 레이저 출력을 조정하여 이미징 장치의 동적 범위 내에서 스폿 이미지를 얻습니다(예: 과도하게 포화된 이미지를 피하기 위해).
   2. 그런 다음 편집 상자에서 간격 시간을 조정합니다. 간격 시간은 기록 간격 시간의 두 배 이상이어야 합니다. 마지막으로 이미징 장치를 녹화 모드로 전환하고 재생 버튼을 클릭합니다. 플레이가 완료되면 명령 창에 "display OK" 문자열이 표시됩니다. 기록을 중지하고 max intensity 방법을 사용하여 기록된 순차적 이미지를 쌓습니다.
6. 4단계 창에서 WM 생성을 클릭하고 위에서 누적 이미지를 선택합니다. 그런 다음 calibration_GUI 창을 닫습니다. 각 스폿의 불균형 강도를 보상하기 위해 가중치 맵을 자동으로 생성합니다.
   참고: 자세한 설명은 여기(https://github.com/ZenKG/SLM_control)에서 다운로드할 수 있습니다.

4. 홀로그램 조명이 있는 이미지 센서를 사용한 Ca²⁺ 이미징(그림 3)

1. AAV를 주입한 마우스를 헤드 플레이트가 있는 마우스의 현미경 아래에 놓습니다(그림 1D).
   참고: 이 과정에서 마우스는 깨어 있는 상태로 구속되지만 불편한 자극에서 벗어날 수 있습니다.
2. 홀로그램 현미경과 모드 잠금 Ti: 25x 대물렌즈로 920nm로 조정된 사파이어 레이저를 사용하여 이광자 이미징(포인트 스캐닝 모드)을 수행합니다(재료 표 참조).
3. 상용 이미징 소프트웨어를 켭니다(재료 표 참조). 라이브 이미징 모드에서 이미지 검출기의 전압(재료 표 참조)과 이미징 레이저의 출력을 조정하여 jGCaMP8f를 발현하는 뉴런의 밝기를 최적화합니다. 이 단백질을 발현하는 뉴런의 이미지를 캡처합니다.
   참고: 이미징 레이저(920nm)의 강도는 20-30mW입니다. FOV는 피질 표면에서 100-150μm의 깊이에서 512μm × 512μm였습니다.
4. jGCaMP8f를 발현하는 특정 뉴런을 홀로그램 조명으로 비추려면 SLMcontrol.m 스크립트 파일을 실행합니다. 참조 이미지를 클릭하고 위에서 획득한 이미지를 선택합니다. 그런 다음 스폿(Spot) 버튼을 클릭하여 지속적인 마우스 클릭으로 이미지의 뉴런에 있는 특정 픽셀을 선택합니다(그림 3A). 선택이 완료되면 키보드의 Enter 버튼을 눌러 완료합니다.
   참고: 디지털 홀로그램은 자동으로 계산되어 SLM(Spatial Light Modulator)에 표시됩니다. 이 패턴은 목록 상자를 클릭하여 다시 방문할 수도 있습니다. SLM에 의해 생성된 단일 스폿의 공간 해상도는 가로 방향을 따라 약 1.2μm, 광축을 따라 ~8.3μm였습니다. 우리는 보다 국부적인 홀로그램 자극을 얻기 위해 높은 개구수(1.1) 대물렌즈를 사용했습니다.
5. 이미지 센서를 사용하여 높은 시간 해상도로 신경 활동을 감지하려면(표 참조) 이미지 획득(그림 3C)을 수행하기 전에 노출 시간, 이미징 영역 및 비닝(그림 3B)을 설정합니다.
   참고: 하나의 뉴런을 지속적으로 자극하는 홀로그램 조명 레이저(920nm)의 강도는 2mW이며, 이는 신경 활동을 감지하기에 충분합니다. 예를 들어, 이미징을 위해 100Hz의 프레임 속도를 달성하려면 노출 시간은 9ms이고, 이미징 영역은 400μm × 400μm이며, 비닝은 4입니다.
6. 실험이 끝나면 마우스를 홈 케이지로 되돌립니다.

5. 홀로그램 현미경을 사용한 광유전학을 사용한 이광자 이미징(포인트 스캐닝 모드)(그림 4)

1. 4.1단계와 4.2단계를 반복합니다.
2. 상용 이미징 소프트웨어를 켭니다(재료 표 참조). 라이브 이미징 모드에서 이미지 검출기의 전압(재료 표 참조)과 이미징 레이저의 출력을 조정하여 GCaMP6m-P2A-ChRmine을 발현하는 뉴런의 밝기를 최적화합니다. 이러한 단백질을 발현하는 뉴런의 이미지를 캡처합니다(그림 1E).
3. 4.4단계를 반복합니다.
4. L2/3 뉴런 내의 기능적 연결성을 조사하려면 SLM을 사용하여 광유전학적 자극의 홀로그램 패턴(ChRmine, 1,040nm)을 생성하고 이를 이광자 Ca²⁺ 이미징(GCaMP6m, 920nm, 512 × 512 픽셀, 2Hz 또는 30Hz, 2x 디지털 줌, 포인트 스캐닝 모드; 그림 3D-H).
   1. 이 프로토콜의 경우 이미징 레이저의 강도를 10-20mW에서 920nm로 설정하고 FOV를 피질 표면에서 100-150μm 깊이에서 측정한 256μm × 256μm로 설정합니다. 픽셀 체류 시간을 2Hz의 경우 1.5μs, 30Hz의 경우 100ns로 설정합니다.
   2. 단일 홀로그램 자극이 뉴런에서 칼슘 반응을 일으켰는지 확인하려면 이미징 프레임 속도로 2Hz와 30Hz를 모두 사용합니다. 신경 활동을 유도하기에 충분한 10mW에서 단일 뉴런을 자극하는 홀로그램 자극 레이저(1,040nm)의 강도를 설정합니다(그림 3D).
      참고: SLM에 의해 생성된 단일 스폿의 공간 해상도는 가로 방향을 따라 약 1.2μm, 광축을 따라 ~8.3μm입니다. 측면 방향에서 접근 가능한 부피 범위는 약 500μm × 500μm 및 축 방향으로 100μm입니다. 또한 2Hz 또는 30Hz 이미징 프레임 속도에서 Ca²⁺ 이미징을 통해 하나의 뉴런뿐만 아니라 여러 뉴런을 동시에 홀로그램으로 자극할 수 있음을 확인했습니다(그림 3E).
5. 다음 프로토콜로 이미지 획득을 수행합니다: 10초의 기준선 주기 후 50ms 동안 8초 간격(0.125Hz)으로 1,040nm에서 10개의 홀로그램 자극으로 920nm에서 Ca²⁺ 응답을 동시에 이미지

화합니다.

결과

그림 1: 실험 절차의 개략도. (A) 헤드 플레이트를 두개골에 고정합니다. (B) 원발성 체감각 피질(S1HL)의 뒷발 부위에 AAV를 정위 주입합니다. (C) 두개골 창의 이식. 신경 활동을 평가하고 조작하기 위해 in vivo Ca²⁺ 이미징은 홀로그램 자극(E)으로 깨어 있는 마우스(

재료