Miniscope를 사용한 쥐 내측 전전두엽 피질의 실시간 칼슘 이미징

초록

출처: Thapa, R., et. al., 심부 뇌를 위한 입체성 바이러스 주입 및 그라디언트 인덱스 렌즈 이식 생체 내 칼슘 이미징. J. Vis. Exp. (2021)

이 비디오는 형질주입된 쥐의 미니스코프를 사용하여 뉴런 활동과 행동을 연관시키는 실시간 칼슘 이미징을 보여줍니다.

프로토콜

미니스코프 장착 및 생체 내 Ca²⁺ 이미징 (그림 1)

1. 미니스코프를 베이스에 장착
   1. 유도실에서 마우스를 잠시 마취합니다(5% 이소플루란 및 1L/min 산소 유속). 깨끗한 벤치 표면에 마우스를 놓습니다.
   2. 작은 드라이버로 잠금 나사를 풀고 보호 캡을 제거한 후 아세톤을 적신 면봉으로 GRIN(그라디언트 인덱스 렌즈) 렌즈 표면을 청소합니다.
   3. PTFE 테이프(폴리테트라플루오로에틸렌 테이프)를 미니스코프 나사산에 단단히 감고 미니스코프를 마우스 헤드의 바닥에 고정합니다.
   4. 미니스코프를 케이블(그림 2K)에 연결하고 NeuView 소프트웨어.
   5. NeuView에서 하드웨어를 클릭하고, LED1를 체크한 후, 스트림 버튼을 클릭하여 라이브 이미지를 봅니다(그림 3A).
   6. 베이스를 기준으로 미니스코프의 위치를 조정하여 최상의 초점면을 식별하고, 뭉툭한 집게를 사용하여 약간 조이거나 풉니다.
      참고: 최상의 초점면은 여러 가능한 위치를 비교하고 대부분의 세포체를 명확하게 시각화할 수 있는 위치를 선택하여 결정됩니다.
   7. 잠금 나사를 조이고 마우스를 홈 케이지에 다시 넣습니다.
   8. NeuView에서 LED 조명 전력을 최적의 수준으로 조정합니다. 캡처 를 클릭한 다음 트리거 버튼을 클릭하여 녹음을 시작하고 150프레임 후 중지 를 누르십시오.
      참고: 가능한 가장 낮은 전력은 충분히 밝은 이미지를 얻기 위한 최적의 LED 전력 수준을 결정합니다. 짧은 비디오를 녹화하는 목적은 반복적인 이미징을 위해 미래에 동일한 초점면을 쉽게 식별할 수 있도록 하는 것입니다.
   9. 미니스코프에서 케이블을 분리합니다. 실험을 시작하기 전에 쥐가 최소 30분 동안 회복되도록 합니다.
      참고: 미니스코프를 보호하기 위해 일반적으로 물병과 와이어 식품 공급기는 이 짧은 시간 동안 제거됩니다. 쥐가 가정용 케이지에 더 오래 머물러야 하는 경우 가정용 케이지에 시중에서 판매되는 다이어트 젤(재료 표 참조)을 제공하는 것이 좋습니다.
2. 생체 내 칼슘 이미징
   참고: 생체 내, 칼슘 이미징은 연구자가 원하는 모든 행동 테스트와 함께 동시에 수행할 수 있습니다. 데모를 위해 여기의 예는 오픈 필드 테스트 중 생체 내 Ca²⁺ 이미징입니다. 이 목표를 달성하려면 두 대의 컴퓨터가 필요합니다. 한 대의 컴퓨터에는 카메라가 마우스 동작을 자동으로 기록하도록 제어하는 상용 소프트웨어(재료 표 참조)가 장착되어 있습니다. 다른 컴퓨터에는 미니스코프를 제어하고 Ca²⁺ 이미지를 기록하기 위한 NeuView가 장착되어 있습니다.
   1. 동작 카메라 소프트웨어(재료 표 참조)를 켜서 라이브 스트림 기능을 통해 마우스 동작 영역을 확인합니다. 상단 카메라의 초점을 수동으로 조정합니다(그림 2L).
   2. 트리거/스트로브를 선택하고 "트리거 활성화/비활성화"를 선택합니다(그림 3B). 레코드 버튼을 클릭하고, 찾아보기 를 사용하여 동작 기록이 저장될 위치를 선택하고, 원하는 이미지 형식을 선택합니다.
      참고: "Trigger Control" 기능은 NeuView 소프트웨어에 의해 동작 기록이 트리거될 수 있도록 활성화되어 동작 프레임과 해당 칼슘 이미징 프레임이 일시적으로 함께 결합되도록 합니다. 동작 기록은 원하는 형식으로 저장할 수 있습니다. 동작 기록은 일반적으로 지정된 폴더에 JPEG 형식으로 저장됩니다.
   3. 마우스를 경기장 가까이로 가져가 미니스코프를 데이터 수집 시스템(그림 2L)에 연결된 케이블에 연결합니다(재료 표 참조). 그런 다음 마우스를 경기장 중앙에 놓습니다.
   4. NeuView 소프트웨어의 Livestream 기능을 사용하여 LED 전력을 조정하여 칼슘 이미지의 밝기를 최적화할 수 있습니다.
      참고: 칼슘 이미징의 경우 녹화 프레임 속도는 기본적으로 10 frames/s입니다.
   5. NeuView에서 LED1의 선택을 취소하고 캡처, , 트리거 버튼을 차례로 클릭하여 녹화를 시작하고 100프레임 후에 중지를 누릅니다.
      참고: LED 조명이 꺼진 상태에서 약 100프레임의 배경 이미지를 녹화하기 위한 것입니다.
   6. 행동 카메라 소프트웨어에서 녹화 시작을 클릭합니다(그림 3C). NeuView에서 LED1을 확인하고 캡처를 클릭한 다음 트리거 버튼을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 3000 프레임 후 중지 를 누르십시오.
      참고: 이것은 칼슘 영상과 행동을 동시에 기록하기 위한 것입니다. 오픈 필드 테스트는 15분 동안 진행되며, 일반적으로 각각 5분씩 3개의 녹음 세션으로 나뉩니다. 이는 미니스코프가 연속 사용으로 인해 과열되는 것을 방지하기 위한 것입니다.
   7. 칼슘 이미징 및 행동 기록을 모두 지정된 폴더에 저장합니다. 각 세션 전에 배경을 녹음하는 동안 두 세션 더 녹음을 반복하고 지정된 폴더에 모든 녹음을 저장합니다.

결과

그림 1: 실험 절차의 개략도. (A) mPFC(medial Prefrontal Cortex)에서 바이러스의 입체주사. (B) mPFC에 GRIN(그라디언트 인덱스 렌즈) 렌즈 이식. (C) 미니스코프 베이스를 쥐의 두개골에 부착합니다. (D) 미니스코프 장착 및 생체 내 칼슘 이미징.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Acetone	Sigma-Aldrich	179124-1L	GRIN 렌즈 클리너
동작 레코딩 소프트웨어(Point Grey FlyCap2)	Point Grey	Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C	동작 기록용
데이터 수집 컨트롤러	NIDA / IRP	이미지	수집 시스템의 맞춤형 구성 요소
데이터 전송 케이블	NIDA / IRP		이미지 획득 시스템의 맞춤형 구성 요소
GRIN 렌즈	GRINTECH	NEM-100-25-10-860-S	GRIN 렌즈 이식 용
미니 스코프	Protolabs	맞춤 설계	장착용
Miniscope 홀딩 암	NIDA/IRP	맞춤 설계	베이스 미니
스코프 보호 캡	Protolabs	맞춤 설계	미니스코프 보호를 위한
모터 컨트롤러	Thorlabs	KMTS50E	베이스 NeuView
	장착용 NIDA/IRP	https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0	생체 내 이미징 용
안과 연고	Puralube Vet Ointment	NDC 17033-211-38	안과
용 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 테이프	TegaSeal PTFE 테이프	A-A-58092	미니 스코프를 바닥에 고정 용
멸균 면봉	Puritan	REF 806-WC	두 수술 모두

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