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동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.
1. 타임랩스 이미징을 위한 현미경 설정
1. 레이저 설정 결정
1. 사용할 레이저 파장을 결정합니다. 관심 형광단의 여기 파장의 두 배인 파장(예: 녹색 형광 단백질(GFP)의 경우 880 및 940nm 사이의 파장)을 사용합니다.
참고: 본 연구에서 GFP의 파장 설정은 880 및 940 nm 사이였습니다. 파장이 높을수록 레이저의 출력 전력이 낮아집니다.
2. 레이저 투과율을 결정합니다. 높은 비율의 레이저 투과는 배아를 죽이므로 가장 낮은 수준의 투과율을 사용합니다(권장). 여기에 제시된 바와 같이 24-48시간 타임랩스 연구의 경우 투과율을 5% 미만으로 유지하십시오.
3. 현미경 검출 시스템을 결정하고 형광단에 대한 올바른 필터가 제자리에 있는지 확인합니다.
참고: 다광자 현미경의 경우 방출된 형광에 대한 다양한 감도를 가진 여러 검출 시스템이 있습니다. 일반적으로 내부 감지 시스템은 외부 감지 시스템보다 민감도가 낮습니다. 높은 수준의 GFP 발현을 가진 형질전환 라인의 경우 내부 검출 시스템이 적합합니다. GFP 발현 수준이 낮거나 다른 형광단(예: 적색 형광 단백질)이 있는 형질전환 라인의 경우, 레이저 투과 비율을 합리적인 수준으로 유지하기 위해 외부 검출 시스템이 필요할 수 있습니다. 사용되는 검출 시스템에 관계없이 형광단에 대한 올바른 필터가 설치되어 있어야 합니다.
2. 다광자 현미경의 소프트웨어 설정 조정
1. 5X 대물렌즈를 사용하여 배아를 찾습니다. 수동으로 스테이지를 가장 높은 위치로 올리고 미세 초점을 사용하여 배아를 현미경 범위의 중간에 배치합니다.
2. 수동으로 스테이지를 낮추고 5X 대물렌즈를 25X 침수 대물렌즈(개구수 NA, 0.95)로 변경합니다. 배아의 초점을 다시 맞추기 위해 스테이지를 조심스럽게 들어 올립니다.
3. 소프트웨어에서 "xyzt" 모드를 클릭하여 "z" 깊이에 걸쳐 x-y 평면에서 시간 간격(t)으로 여러 이미지를 얻습니다. epifluorescence 또는 brightfield view를 사용하여 Z 스택의 경계를 설정하는 관심 영역의 초점 심도를 찾습니다.
1. 소프트웨어에서 "시작" 버튼을 클릭하십시오. 이 실험에서 눈의 측면 가장자리는 Z 스택의 시작이었습니다. "종료" 버튼을 클릭하십시오. 배아의 정중선은 Z-stack.
참고: 단계 크기는 0.3-0.6 μm였으며 60 - 120 μm의 z-스택 크기에 대해 총 ~200 단계가 있었습니다).
4. 수집 시간 및 이미징 빈도를 조정하기 위한 메뉴를 클릭합니다.
현재 시스템의 경우 각 z-stack 획득에 대해 ~200 단계가 약 5분이 소요됩니다. 형광단의 적절한 회수와 배아의 생존을 위해 z-stack 획득(레이저 전원 켜기)과 회복 시간(레이저 전원 끄기) 사이에 최소 1:3의 비율을 허용하십시오.
참고: 예를 들어, z-stack은 5분의 z-stack 획득과 15분의 회복으로 20분마다 획득됩니다. 이 프로토콜의 경우 더 큰 z-스택을 얻을 수 있지만 z-stack 획득 사이의 시간을 적절하게 증가시켜 타임랩스 과정에서 더 적은 이미지를 얻을
수 있습니다.
1. 배아 회복을 위한 적절한 시간을 두고 지정된 창에서 z-stack 사이의 시간을 설정합니다. 적절한 창에서 실험의 총 시간을 설정합니다.
5. 최종 소프트웨어, 레이저 및 배아 조정.
1. 라이브 이미지 설정을 켜서 레이저 설정을 최종적으로 조정합니다. 소프트웨어 내에서 레이저 투과율, 게인 및 오프셋 슬라이더 막대를 조정하여 형광 이미지를 최적화할 수 있습니다. 또한 실험 길이, 배아의 예상 성장 등에 따라 필요에 따라 배아의 방향을 조정합니다. 실험 기간 동안 관심 영역이 프레임 내에 남아 있는지 확인합니다.
2. 타임랩스 획득 중에 더 이상 필요하지 않은 에피오레쇼트 광원을 끕니다. 레이저 안전 상자로 스테이지를 덮습니다(그림 1I). 내부 감지 시스템을 사용할 때 레이저 안전 상자는 배경 조명으로부터 보호하기에 적합합니다. "시작"을 누릅니다.
참고: 그러나 더 민감한 외부 감지 시스템의 경우 레이저 안전 상자가 충분한 배경 조명을 차단하지 못하며 이미지 획득 중단을 방지하기 위해 추가 덮개가 필요합니다.
2. 타임랩스 획득 중
1. 레이저 안전 상자의 슬라이딩 도어를 통해 타임랩스를 획득하는 동안 8-12시간마다(하루에 최소 2회) 개방형 배아 배지를 개방형 배아 배지로 다시 채웁니다(그림 1I).
2. 레이저 안전 상자의 문을 열기 전에 현미경이 이미지를 적극적으로 획득하고 있지 않은지 확인하십시오.
참고: 24시간에서 48시간 동안 지속되는 타임랩스 이미징 실험에는 히터 및 순환 매체 시스템의 사용이 필요하지 않습니다. 실제로, 스테이지 히터와 인라인 히터의 온도는 모두 제어하기 어려우며, 이미지 획득 중에 배아는 25-28°C의 온도 범위에서 적절한 발달 속도를 나타냅니다. 또한 순환 미디어 시스템은 오버플로되어 잠재적으로 장비를 손상시키는 경향이 있습니다. 따라서 모든 배아는 일상적으로 획득 후 단계화됩니다.
3. 획득 후 처리
1. 소프트웨어에서 "파일" 메뉴를 클릭하고 "저장"을 선택합니다.
2. 이미지 처리 소프트웨어에서 파일을 엽니다(재료 표 참조). 올바른 이미지 시리즈를 강조 표시합니다. 소프트웨어에서 "프로세스" 메뉴를 선택합니다. 3D 디콘볼루션을 클릭하고 "적용"을 클릭하여 각 z-stack.
참고: 파일이 큽니다. 따라서 이 단계에는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
3. 소프트웨어의 "프로세스" 메뉴에서 "최대 투영"을 클릭합니다. "적용"을 클릭하여 z-스택당 1개의 이미지를 생성하는 최대 프로젝션을 시작합니다. 각 최대 투영 파일(z 스택당 1개 이미지)을 tiff로 내보냅니다.
4. 개별 tiff 파일을 비디오 처리 소프트웨어로 가져옵니다. 모든 tiff 파일을 선택하고 비디오 편집기로 드래그합니다. 동영상 내 각 이미지의 길이를 0.1초로 조정합니다. 비디오를 mov 또는 mp4 파일로 내보냅니다.
