Visualization of Axonal Projection Patterns of Embryonic Motor Neurons in Drosophila (초파리에서 배아 운동 뉴런의 축삭 투영 패턴의 시각화)

1. 준비:

1. 1X PBS 500mL에 소 혈청 알부민(BSA) 0.5g과 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(재료표 참조) 0.5mL를 첨가하고 최소 30분 동안 교반하여 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(PBT) 용액과 함께 인산염 완충 식염수(PBS) 500mL를 준비합니다.
2. 10mL의 탈이온수에 16% 스톡 파라포름알데히드 용액 2.5mL와 10x PBS 1mL를 첨가하여 4% 파라포름알데히드 1mL를 만듭니다. 4 °C에서 보관하고 일주일 이내에 사용하십시오.
   주의: 파라포름알데히드 용액은 독성이 높으므로 피부 접촉을 피하십시오.
3. DMSO 1mL당 0.1g의 X-Gal 기질을 용해하여 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside(X-Gal) 기질(DMSO)의 10% w/v X-Gal)을 만듭니다. -20 °C에서 100 μL 분취액에 넣어 보관하십시오.
4. 10mM 인산염 완충액(pH 7.2), 150mM 염화나트륨, NaCl, 1mM 염화마그네슘, MgCl₂, 3mM 페로시아나이드 칼륨, K₄[FeII(CN)₆], 3mM 페리시아나이드 칼륨, K₃[FeIII(CN)₆] 및 0.3% t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올을 사용하여 X-Gal 염색 용액을 만듭니다. 어두운 곳에서 4 °C에서 보관하십시오.
5. 30% 스톡 과산화수소를 탈이온수로 1:10으로 희석하여 3% 과산화수소 용액을 만듭니다.
6. 3,3mL의 새 PBT 용액에 1정(10mg)의 DAB를 완전히 용해하여 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 용액을 만듭니다. 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과하고 910μL 분취량에 -20°C에서 보관하십시오.
   주의: 모든 DAB 폐기물을 표백제에 버리고 DAB를 파괴하십시오.
7. 사과 주스로 달걀 접시를 만드십시오. 35L의 플라스크에 35g의 한천과 1L의 탈이온수를 추가합니다. 33L 플라스크에 자당 33g, 테고셉트 2g, 사과 주스 375mL를 추가합니다. 30분 동안 고압증기멸균으로 녹입니다. 두 용액을 모두 약 60 ° C로 식히십시오. 교반하여 이러한 용액을 잘 결합하고 혼합하십시오. 60mm 배양 접시당 결합된 용액 ~11mL를 붓습니다.
8. 베이커리 효모를 탈이온수(1:0.8 비율)에 섞어 이스트 페이스트를 만들고 4°C에서 보관합니다.

2. 배아 채취(1일차)

1. 어린 암컷과 수컷(5일 미만)을 채취하여 1-2일 동안 중앙에 소량의 효모 페이스트가 들어있는 난자판(60mm x 15mm)이 있는 플라스틱 비커 케이지에 보관합니다.
2. 16기 말기 배아를 최적으로 채취하기 위해서는 오후 5시경에 파리(> 50)가 있는 젖병을 설치하고 25°C에서 3시간 동안 알을 낳습니다.
3. 파리를 신선한 음식 병에 옮깁니다.
4. 뚜껑이 있는 달걀 플레이트를 닫고 25°C의 가습 인큐베이터(~70% 습도)에서 하룻밤 동안 거꾸로 배양합니다.

3. 면역염색을 위한 배아 준비(2일차)

1. 오전 10시 20분경에 난자 플레이트에 PBT 용액 1.8mL를 넣고 면봉을 사용하여 플레이트를 기울이면서 플레이트에서 배아를 느슨하게 합니다.
   참고: 면봉을 사용하여 효모 페이스트를 부드럽게 으깨서 많은 수의 배아가 발견될 경우 용해합니다. 고정 ~40분 전(오전 11:00경)부터 배아 수집을 시작합니다.
2. 1mL 피펫 팁을 사용하여 난자 플레이트에서 1.5mL 마이크로튜브로 배아를 옮깁니다.
3. 배아가 안정되도록 하고 PBT 용액을 가능한 한 많이 흡인합니다. 1mL의 PBT 용액으로 배아를 두 번 헹굽니다. PBT 용액을 최대한 흡입합니다.
4. 튜브에 50% 표백제(즉, 탈이온수로 희석된) 1mL를 채우고 실온(RT)에서 3분 동안 배아에서 배아를 배양하여 배아를 탈이온화합니다.
   참고: 이 단계는 탈이온화된 배아를 죽이지 않습니다.
5. 탈각된 배아가 안정되도록 하고 50% 표백제를 최대한 흡인하고 PBT 용액 1mL로 배아를 3회 헹굽니다.
6. 0.5mL의 헵탄을 첨가한 후 0.5mL의 4% 파라포름알데히드 용액을 오전 11:00경 RT에서 튜브에 추가합니다.
7. RT에서 15분 동안 배아를 영양 주입기에서 배양합니다.
8. 4% 파라포름알데히드 용액(맨 아래 층)을 제거합니다.
9. 0.5mL의 100% 메탄올을 첨가하고 튜브를 30초 동안 세게 흔들어 배아를 데비텔린화합니다.
10. 헵탄(즉, 최상층)을 제거합니다.
11. 0.5mL의 100% 메탄올을 넣고 튜브를 10초 동안 세게 흔듭니다.
12. 튜브를 두드려 배아가 안정되도록 하고 가능한 한 많이 메탄올을 흡인합니다. 배아를 1mL의 100% 메탄올로 헹구고 10초 미만으로 흔듭니다.
    참고: 메탄올에 장기간 노출되면 β-Gal 활성이 파괴됩니다.
13. 메탄올을 제거하고 데비텔린화된 배아를 PBT 용액 1mL로 3회 헹굽니다.

4. LacZ 염색을 사용한 배아 유전형 분석(2일차)

1. PBT 용액 1mL를 튜브에 넣고 37°C 가열 블록 또는 수조에서 15분 동안 튜브를 배양합니다.
2. 배양하는 동안 X-Gal 염색 용액(튜브당 1mL)을 65°C의 수조에 탁해질 때까지 놓습니다. 37 °C 수조에서 배양하십시오.
3. PBT 용액을 흡입하고 X-Gal 염색 용액 1mL와 X-Gal 기질 20μL를 튜브에 추가합니다.
4. 파란색 침전물이 분명해질 때까지 너트를 사용하여 37°C에서 튜브를 배양합니다.
   참고: 일반적으로 2번째 및 3번째 파란색 밸런서의 배양 시간은 2-4시간입니다.
5. X-Gal 염색 용액을 제거하고 RT PBT 용액 1mL로 배아를 3회 헹굽니다.
6. 바늘 프로브 또는 집게를 사용하여 광해부 현미경(1.6X-2.5X 대물렌즈)으로 원하는 유전자형(즉, 염색되지 않은 백색 배아)의 배아를 수동으로 분류합니다.
   참고: CyO, actin-LacZ 및 TM3, actin-LacZ와 같은 일부 블루 밸런서는 액틴의 제어 하에 박테리아 β-Gal(LacZ)을 발현하는 형질전환 구조를 가지고 있습니다 프로모터, 유비쿼터스 방식으로 파란색으로 염색된 배아는 하나 또는 두 개의 파란색 밸런서 염색체 사본을 포함합니다. 그러므로, 염색되지 않은 백색 배아는 원하는 치사적 대립유전자에 대해 동형접합적입니다.

5. Anti-Fasciclin II 항체를 사용한 배아의 면역염색(2-3일차)

1. 1mL 피펫 팁을 사용하여 원하는 유전자형(즉, 염색되지 않은 백색 배아)의 배아를 수집하여 0.5mL 마이크로튜브에 이식합니다.
   참고: 이 단계에서 배아는 큐티클의 분할 패턴과 머리와 꼬리의 구조를 포함한 형태학적 기준에 따라 대략적으로 병기를 결정할 수 있습니다. 난자를 낳은 후 10시간에서 16시간 사이에 두부 침공 동안, 배아는 앞쪽 분절의 뚜렷한 감소를 겪습니다.
2. 0.4mL의 PBT 용액으로 배아를 한 번 세척하고 0.3mL의 차단 용액(PBT 용액에 5% 일반 염소 혈청 및 5% DMSO)을 추가합니다.
3. RT에서 15분 동안 장동으로 배아를 차단합니다.
4. 75μL의 항-파시클린 II 항체를 추가하고 RT에서 밤새 너트레이션으로 튜브를 배양합니다.
5. 0.4mL의 PBT 용액으로 배아를 세척당 최소 20분 동안 4회 세척합니다.
6. 염소 항-마우스-홀스래디쉬 퍼옥시다제(anti-mouse-HRP) 항체(2μg/mL)가 포함된 차단 용액 0.3mL(PBT 용액에 5% 일반 염소 혈청)를 추가하고 RT에서 밤새 너트레이션으로 튜브를 배양합니다.
7. 0.4mL의 PBT 용액으로 배아를 세척당 최소 20분 동안 6회 세척합니다.
8. 튜브에 0.3mL의 DAB 용액을 추가합니다.
   주의: 장갑을 착용하고 모든 DAB 폐기물/튜브/팁을 표백제에 넣습니다.
9. 2μL의 3% 과산화수소를 추가하고 원하는 양의 침전물이 생성될 때까지 RT에서 너트레이션으로 암흑 속에서 튜브를 배양합니다.
   참고: 일반적으로 1D4 면역조직화학의 배양 시간은 0.5-1시간 사이입니다.
10. 0.4mL의 PBT 용액으로 배아를 4회 세척합니다.
    주의: DAB 용액과 처음 두 번은 피펫으로 세척하고 표백제로 버립니다.
11. 튜브에 장착 70% 글리세롤/PBS 용액 0.2mL를 추가하고 실온 또는 4°C에서 보관하십시오.
    참고: 튜브를 빛으로부터 멀리 두십시오. 배아를 90% 글리세롤/PBS 용액에 넣음으로써 보다 명확한 제제를 얻을 수 있습니다. 그러나 90% 글리세롤/PBS 용액에서 투명화된 배아를 해부하는 것은 70% 글리세롤/PBS 용액에서 투명화된 배아보다 더 어렵습니다.

6. 배아의 준비, 해부, 장착 및 이미징(4일차)

1. 병기를 위해 70% 글리세롤/PBS로 평형을 이룬 배아를 유리 슬라이드에 이식합니다.
2. 복부 분절 7(A7), A8 및 A9 분절 신경(ISN) 신경이 서로 닿도록 수렴하거나 3개의 띠로 세분화된 중장을 가진 16기 후기 배아를 수집합니다.
   참고: 1D4 항체로 염색된 배아는 ISN 및 ISNb 운동 축삭의 투영 패턴을 기반으로 병기를 결정할 수 있습니다. 중추신경계(CNS)를 빠져나온 후, 16기 후반 배아의 A7, A8 및 A9 ISN 신경은 서로 접촉하기 위해 수렴하고, 그 후 갈라져 등쪽 근육(그림 1A의 화살촉)까지 멀리 뻗어 나간다. 그러나 16기 중반 배아에서는 A7 ISN 신경이 A8/A9 신경과 평행하게 확장됩니다(그림 1B의 대괄호). 또한, 양쪽 반분절에 있는 A6 ISNb 신경(복외근에 수직)의 투영 축은 CNS 세로 축삭 근막의 뒤쪽 끝과 대략 정렬되어 있습니다(그림 1C의 화살표 및 선). 이러한 형태학적 기준은 유전자형에 따라 다릅니다. 또는 장 형태에 따라 배아를 병기화할 수 있습니다. 17기 이전에는 중장이 심장 모양을 하는 반면, 중장은 17기까지 세 개의 띠로 나뉩니다.
3. 배아를 해부합니다.
   1. 1mL 주사기를 사용하여 글리세롤 방울에서 각 배아를 꺼내고 배아를 복부 앞면이 위로 향하게 놓습니다. 몸 길이의 1/4 지점에서 앞쪽 부분과 운동 축삭돌기가 없는 가장 뒤쪽 부분을 잘라냅니다.
   2. 바늘 탐침을 사용하여 글리세롤 방울에서 끝 절단 배아를 옮기고, 등쪽이 위로 향하도록 굴린 다음 필드에 수평으로 놓습니다.
      참고: 배아가 글리세롤 방울에서 나올 때, 배아와 관련된 약간의 글리세롤이 배아를 끈적하게 만듭니다.
   3. 하나의 매우 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 등쪽 정중선을 따라 배아를 자릅니다. 배아의 뒤쪽 끝을 작게 자른 다음 앞쪽을 향해 등쪽 정중선을 계속 자릅니다. 반대 방향으로 자르는 것도 괜찮습니다.
   4. 바늘 프로브를 사용하여 정중선 절단 배아를 글리세롤 방울로 이동시키고, 등쪽이 위로 향하게 배치하고, 각 체벽을 복측(대각선) 방향(2.5X 대물렌즈)으로 펼쳐 체벽에서 장을 분리합니다.
      참고: 등쪽 정중선이 완전히 절단되어 왼쪽과 오른쪽 체벽이 완전히 분리되었는지 확인합니다.
   5. 글리세롤 방울에서 정중선 절단 배아를 조심스럽게 옮긴 다음 가는 바늘 프로브(2.5X 대물렌즈)를 사용하여 체벽의 두 플랩을 유리 슬라이드에 놓습니다.
   6. 매우 가는 텅스텐 바늘을 사용하여 절개된 배아를 옆으로 밀어 내부 장기를 제거합니다(5X 대물렌즈).
      참고: 다른 유사한 해부 절차에 대한 자세한 설명은 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
4. 장착을 위해 2-3μL의 70% 글리세롤/PBS 용액을 세척하고 절개된 배아에 첨가한 다음, 미세 바늘 프로브를 사용하여 8μL의 70% 글리세롤/PBS 용액이 중앙에 펼쳐진 새 유리 슬라이드(2.5X 대물렌즈)로 배아를 옮깁니다.
5. 커버슬립(18mm x 18mm)을 착용합니다. 커버슬립의 가장자리를 일반 매니큐어로 밀봉합니다(투명하거나 착색된 것이 좋습니다).
6. 제조업체의 지침에 따라 미분 간섭 대비(DIC) 광학 현미경에서 고해상도(20X, 40X 및 63X 오일 이멀젼 대물렌즈)로 이미지를 캡처합니다.
   참고: 특히 ISNb 모터 축삭돌기의 경우 63X 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 더 나은 시각화 및 표현형 특성화를 생성할 수 있습니다.

그림 1: ISN 및 ISNb 운동 축삭돌기의 투영 패턴을 기반으로 한 배아의 병기. (A) 16기 말기에는 야생형 배아인 A7, A8, A9 ISN 신경(화살표)이 서로 접촉하기 위해 수렴합니다(화살촉). 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 스케일 바 = 15 μm. (B) 16기 중반 야생형 배아에서 A7 ISN 신경은 A8/A9 신경(대괄호)과 평행하게 확장됩니다. 화살표는 A7, A8 및 A9 ISN 신경을 나타냅니다. 앞쪽은 왼쪽이고 복부는 아래쪽입니다. 스케일 바 = 15 μm. (C) FasII 항체로 염색된 16기 후기 야생형 배아의 필레티드 제조. 좌측 및 우측 A6 ISNb 신경의 투영 축(화살표)은 CNS 세로 축삭 근막(검은색 선)의 뒤쪽 끝과 대략 정렬되어 있습니다. 복부 분절 A1-A7은 상단에 표시되어 있습니다. 앞쪽이 왼쪽입니다. 스케일 바 = 15μm.